表面活性劑SDS協(xié)同提取槐米總黃酮的實驗研究

冀德富，郭茹茹，薛文娟，徐 靜

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

中藥槐米是豆科植物槐Sophora japonicaL.的花蕾，夏季形成時采收，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，其味苦，性微寒，歸肝、大腸經(jīng)，具涼血止血、清肝瀉火之功效［1］?；泵椎膽?yīng)用非常廣泛，目前已應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域［2-5］?；泵赘缓S酮類成分如蘆丁、槲皮素等，尚含有皂苷、多糖和黏液質(zhì)等［6］。表面活性劑分子可增加大分子有機物質(zhì)的溶解滲出能力［7］，目前已被初步應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取中，但利用表面活性劑的增溶作用協(xié)同提取槐米總黃酮尚未見報道。本實驗通過比較表面活性劑十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）協(xié)同超聲和協(xié)同回流提取以及單純超聲、回流等多種方法提取槐米總黃酮的得率，以期選擇合理可行的提取方法，為后續(xù)實驗研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

UV-6100S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；SB-5200DTDN型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋、電熱套等。

1.2 實驗材料

槐米，河北亞寶藥業(yè)有限公司出品，經(jīng)我校藥用植物學(xué)科平莉莉老師鑒定為正品；蘆丁對照品（批號：20160920，純度：＞98%），成都曼思特生物科技公司；十二烷基硫酸鈉，乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等化學(xué)試劑均為分析純（天津北辰方正試劑廠），實驗用水為蒸餾水。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 提取方法

2.1.1 超聲水提取法 精密稱取槐米藥材粗粉2 g，2份，分別置于錐形瓶中，記為樣品1、2。1號中加入0.1 g的 SDS，2號中不加。分別加入蒸餾水30 mL（料液比 1∶15），置于超聲儀（150 W，30 ℃）超聲提取30 min，抽濾，濾液加水定容于100 mL容量瓶中，得到樣品液1、2。

2.1.2 沸水浸泡+超聲水提取法 精密稱取槐米藥材粗粉2 g，2份，分別置于錐形瓶中，記為樣品3、4。3 號中加入 0.1 g的 SDS，4 號中不加。分別加入沸水30 mL，浸泡20 min，置于超聲儀超聲提取30 min，抽濾，濾液加水定容于100 mL容量瓶中，得到樣品液3、4。

2.1.3 超聲醇提取法 精密稱取槐米藥材粗粉2 g，2份，分別置于錐形瓶中，記為樣品5、6。5號中加入0.1 g的SDS，6號中不加。分別加入60%乙醇30 mL，置于超聲儀超聲提取30 min，抽濾，濾液加60%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到樣品液 5、6。

2.1.4 回流水提取法 精密稱取槐米藥材粗粉2 g，2份，分別置于圓底燒瓶中，記為樣品7、8。7號中加入0.1 g的SDS，8號中不加。分別加入沸水30 mL，電熱套回流提取30 min，抽濾，濾液加水定容于100 mL容量瓶中，得到樣品液7、8。

2.1.5 回流醇提取法 精密稱取槐米藥材粗粉2 g，2份，分別置于圓底燒瓶中，記為樣品9、10。9號中加入0.1 g的SDS，10號中不加。分別加入60%乙醇30 mL，水浴回流提取30 min，抽濾，濾液加60%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到樣品液9、10。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取對照品蘆丁12.16 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液。（每1 mL中含蘆丁 0.243 2 mg）。

2.2.2 供試品溶液的配制 從樣品液1～10中精密移取1～3 mL于25 mL容量瓶中，用提取溶劑定容至刻度，即得。

2.2.3 測定波長的確定 精密移取對照品溶液2.5 mL，置 25ml容量瓶中，參考 2015 年版《中國藥典》中槐米總黃酮的測定方法［1］，用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉體系進行顯色，即：加蒸餾水至6.0 mL，再加5%NaNO2溶液1 mL（混勻，放置6 min），然后加10%Al（NO3）3溶液1 mL（混勻，放置6 min），最后加NaOH試液10 mL，補加蒸餾水至刻度后搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在300～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖1所示，蘆丁對照品的最大吸收波長為513 nm。

精密量取10號供試品溶液1 mL，同法顯色和掃描，結(jié)果如圖2所示，其最大吸收波長亦為513 nm。

圖1 對照品顯色掃描圖

圖2 供試品顯色掃描圖

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取對照品溶液2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，按2.2.3項下方法顯色，以不含蘆丁對照品的相應(yīng)試劑為空白，在513 nm處測定吸光度A，以A對質(zhì)量濃度C（mg/mL）進行線性回歸，得到方程為A=0.013 5C-0.049 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0。結(jié)果蘆丁線性質(zhì)量濃度范圍在19.46 μg/mL～58.37 μg/mL。

2.2.5 精密度實驗 精密移取2 mL對照品溶液，6 份，置 25 mL 容量瓶中，按 2.2.3 項下方法顯色測定吸光度，結(jié)果分別為 0.289，0.291，0.286，0.287，0.293，0.291，RSD為 0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 精密移取10號供試品溶液2 mL，置 25 mL 容量瓶中，按 2.2.3 項下方法顯色后分別于 0、30 min、60 min、90 min、120 min、180 min測定吸光度，結(jié)果為 0.645、0.642、0.638、0.631、0.629、0.625，RSD為 1.24%，表明顯色液在 3 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性實驗 精密稱取槐米藥材粗粉2 g，6份，按2.1項下樣品10的方法進行提取，制備6份供試品溶液，按2.2.3項下方法顯色后測其吸光度，計算總黃酮的提取率，結(jié)果為 18.15%、17.78%、18.32%、17.90%、18.01%、18.17%，平均提取率為18.06%，RSD為 1.09%，表明該法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率實驗 精密稱取槐米藥材粗粉1 g，6份，按2.1項下樣品10的方法進行提取，制備6份供試品溶液，精密移取各供試品溶液2 mL，加入一定量的對照品，置于50 mL的容量瓶中，加60%乙醇至刻度，從中精密移取1 mL，按2.2.3項下方法顯色，測定吸光度，計算加樣回收率和RSD值。結(jié)果如表1顯示，加樣回收率在93.89%～104.57%，平均加樣回收率為 98.26%，RSD為3.66%，因此，該方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 加樣回收率試驗

2.2.9 樣品測定 從1～10的供試品溶液中精密移取 1 mL，按 2.2.3項下方法顯色，測定吸光度，計算槐米中總黃酮的提取率。結(jié)果見表2。

表2 不同方法提取實驗結(jié)果

由表2可知，提取溶劑為水時，無論是超聲提取還是回流提取，SDS的加入，槐米總黃酮的提取率是增加的，SDS起到了增溶提取的作用。如果在超聲水提取時，槐米粗粉用沸水浸泡后再超聲提取，其總黃酮提取率有所提高，原因是沸水浸泡使得槐米藥材中的酶失活，同時部分黃酮成分被浸提出來，故沸水浸泡有助于超聲提取槐米總黃酮。提取溶劑為60%乙醇時，表面活性劑SDS的加入，其增溶效果不明顯，特別是回流提取時，與不加SDS的單純回流提取相比較，槐米總黃酮提取率幾乎一樣。因此，可以推斷出，SDS的增溶作用與溶劑有關(guān)。

比較上述各提取方法，60%乙醇回流提取槐米總黃酮，其提取率最高，表面活性劑SDS的加入對其無影響，因此實際生產(chǎn)中，提取槐米總黃酮如果選擇一定濃度的乙醇作溶劑，無須加入表面活性劑；如果提取溶劑用水，可以加入適量的表面活性劑以促進提取。

3 討 論

表面活性劑應(yīng)用甚廣，在中藥材提取方面亦有不少應(yīng)用研究報道。因黃酮類化合物通常會與糖結(jié)合成苷類，相對分子量較大，表面活性劑的親水親油即雙親結(jié)構(gòu)可以顯著降低固液界面張力，對大分子化合物有較好的增溶效果，同時表面活性劑還可以顯著提高水溶性較差的黃酮苷元在水液中的溶解度，故表面活性劑對黃酮類成分的提取有很好的協(xié)同作用，能夠顯著提高總黃酮的提取率［8］。但影響表面活性劑增溶作用的因素很多，如溫度、無機鹽、聚合物等［9］。本實驗研究顯示，提取溶劑是影響表面活性劑SDS增溶效果的因素之一，以表面活性劑的水溶液為提取溶劑，增溶效果明顯，在中藥有效成分提取中有一定的應(yīng)用價值。