EGCG恢復(fù)Sirt-1拮抗高糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡

袁 暉，朱明亮，閆國防

(中國人民解放軍第一六九醫(yī)院 神經(jīng)外科，湖南 衡陽 421000)

高糖微環(huán)境會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的病理生理變化，如自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[1]等，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)中樞性及周圍性病變，危害人類的健康。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是綠茶中提取的多酚的活性成分，對細(xì)胞具有保護作用，如緩解氧化應(yīng)激[2]，抑制脂質(zhì)聚集，減輕自噬[3]等，在神經(jīng)系統(tǒng)化方面，在促進神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，抗炎等方面具有積極的作用。

Sirt-1是依賴于NAD+的組蛋白去乙酰化酶，在生物體中廣泛存在并調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活。Nagar等發(fā)現(xiàn)Sirt-1能夠介導(dǎo)因氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷的保護作用[4]；在神經(jīng)研究方面，Sirt-1能夠介導(dǎo)缺血再灌注腦損傷的神經(jīng)保護作用[5]，因此，我們聯(lián)想到，EGCG發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護作用，Sirt-1是否參與其中。我們實驗發(fā)現(xiàn)，EGCG對高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的損傷提供了一定的保護作用，Sirt-1介導(dǎo)其中。這些研究結(jié)果為糖尿病神經(jīng)細(xì)胞損傷的藥物研究提供了思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)使用DMEM(Hyclone)培養(yǎng)基加入10%胎牛血清(Gibico)，于27℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育維持。取對數(shù)期細(xì)胞根據(jù)實驗需要，種植于6、24及96孔的實驗板(Corning)中進行培養(yǎng)、觀察及提取蛋白。

1.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測PC12細(xì)胞的活性 取對數(shù)期細(xì)胞種植于96孔板，待細(xì)胞密度約75%時加入相應(yīng)濃度的藥物處理細(xì)胞，每一濃度至少3個實驗樣本，孵育24 h后，試驗孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8試劑(Solarbio)，孵育2 h，使用酶標(biāo)檢測儀450 nm觀察OD數(shù)值，并統(tǒng)計分析。

1.3 ELISA法檢測Bcl-2的表達(dá)活性 取對數(shù)期細(xì)胞加入對應(yīng)濃度的藥物處理細(xì)胞24 h，提取細(xì)胞蛋白并定量。按照ELISA試劑盒(Invitrogen)中的說明書配置試劑：以每孔100 μL將細(xì)胞蛋白加入酶標(biāo)板內(nèi)，覆膜于搖床上室溫進行3 h孵育，除去酶標(biāo)板內(nèi)液體使用1×洗滌液清洗2次，每孔加入1×活性液200 μL，酶標(biāo)檢測儀450 nm觀察OD數(shù)值，并統(tǒng)計分析。

1.4 免疫熒光檢測細(xì)胞胞質(zhì)Caspase-3及胞核DAPI的表達(dá) 對數(shù)期細(xì)胞種植于24孔板，待細(xì)胞密度約75%時加入對應(yīng)濃度的藥物，孵育24 h，PBS清洗1次，冰甲醇固定10 min。加入Caspase-3一抗(Abcam)，室溫孵育1 h；PBS清洗2次，加入熒光二抗(Solarbio)室溫避光孵育1 h；PBST清洗1次，加入DAPI，室溫孵育2 min。熒光顯微鏡10×40倍率觀察并拍照。

1.5 Western-Blot法檢測Sirt-1的表達(dá) 取對數(shù)期細(xì)胞加入對應(yīng)濃度的藥物處理24 h，提取細(xì)胞蛋白并定量。使用凝膠進行蛋白電泳，PVDF膜采用半干法轉(zhuǎn)膜30 min；TBST加入5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入Sirt-1一抗(Abcam)封閉孵育12 h，TBST清洗3次，加入二抗(Cell Signaling)搖床孵育2 h，TBST清洗3次后使用成像儀顯影。

1.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)中的最小顯著差異檢驗(LSD-test)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高濃度葡萄糖誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡 使用不同濃度的葡萄糖(15、 30、 45 mmol/L)處理PC12細(xì)胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞的活性隨葡萄糖給予濃度的遞增而下降(圖1A，F(xiàn)=2.36，P<0.05)，較對照組分別下降了14%、32%及57%；使用ELISA法檢測了Bcl-2的表達(dá)，由圖1B可見，具有抑制凋亡作用的Bcl-2蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)了同樣的趨勢(圖1B，F(xiàn)=11.05，P<0.05)，較對照組分別下降了8%、30%及35%；為了更直觀地觀察細(xì)胞凋亡的發(fā)生，我們采用免疫熒光觀察細(xì)胞質(zhì)中凋亡蛋白家族的成員Cleaved-Caspase3的表達(dá)活性，由圖1C中紅色熒光染色的Cleaved-Caspase3可以觀察到，葡萄糖處理后的PC12細(xì)胞的胞質(zhì)中，紅色熒光聚集密度較對照組有明顯增加，與處理濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。此外，我們使用DAPI對細(xì)胞核進行了染色，葡萄糖損傷組的熒光強度增高，以上表明，高濃度葡萄糖對PC12細(xì)胞造成了明確的損傷。

2.2 EGCG保護高糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡 與葡萄糖30 mmol/L損傷組相比，加入EGCG(10、20、40 μmol/L)對細(xì)胞活力提升具有積極的作用，細(xì)胞活性較損傷組分別提升了2%、20%及24%，細(xì)胞活力的提升率與EGCG濃度呈現(xiàn)正相關(guān)(圖2A，F(xiàn)=1.98，P<0.05)，而單獨使用EGCG對PC12細(xì)胞活力無明顯影響；加入EGCG處理后，Bcl-2的表達(dá)分別提升了10%、22%和25%，20 μmol/L濃度以上的EGCG對Bcl-2的表達(dá)具有明確的統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B，F(xiàn)=23.67，P<0.01)；由圖2C可以觀察到，胞質(zhì)中紅色熒光染色的Cleaved-Caspase3在加入EGCG保護組中的熒光強度和密度，相比較損傷組有一定程度的減弱。以上結(jié)果表明，EGCG對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護作用。

2.3 EGCG拮抗高糖對Sirt-1表達(dá)的抑制 與對照組相比，葡萄糖損傷組抑制了Sirt-1的表達(dá)，加入EGCG后則一定程度恢復(fù)了Sirt-1的表達(dá)，單獨使用EGCG則對Sirt-1表達(dá)影響的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3，F(xiàn)=14.71，P<0.01)。

A.CCK-8檢測PC12細(xì)胞活力；B.ELISA法檢測Bcl-2的表達(dá)；C.免疫熒光觀察胞核內(nèi)Cleaved-Caspase3表達(dá)活性，觀察胞核中DAPI的表達(dá)。

A.CCK-8檢測PC12細(xì)胞活力；B.ELISA法檢測Bcl-2的表達(dá)；C.免疫熒光觀察胞核內(nèi)Cleaved-Caspase3表達(dá)活性，觀察胞核中DAPI的表達(dá)。**P<0.001，*P<0.01，vs. 對照組；&&&P<0.001，&&P<0.01，&P<0.05，vs. 葡萄糖損傷組(Glu 30 mmol/L)。

2.4 Sirt-1阻斷劑Sirtinol逆轉(zhuǎn)了EGCG對PC12細(xì)胞的保護作用 通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)濃度為15 μmol/L的Sirtinol在不明顯損傷細(xì)胞的同時能對Sirt-1發(fā)揮較好的阻斷作用。由圖4可以得知，加入Sirtinol與EGCG同時處理組的細(xì)胞活性較EGCG保護組下降了8%(F=1.59，P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)下降了16%(F=37.96，P<0.01)；Cleaved-Caspase3在胞質(zhì)中的熒光強度也出現(xiàn)了對應(yīng)的增高，提示Sirt-1介導(dǎo)了EGCG對PC12細(xì)胞的保護作用。

A.CCK-8檢測PC12細(xì)胞活力；B.ELISA法檢測Bcl-2的表達(dá)；C.免疫熒光觀察胞核內(nèi)Cleaved-Caspase3表達(dá)活性，觀察胞核中DAPI的表達(dá)。

3 討論

相關(guān)實驗證實，持續(xù)的高糖微環(huán)境會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，出現(xiàn)一系列神經(jīng)細(xì)胞損傷引起的并發(fā)癥，危害人們的健康及生存質(zhì)量。因此尋求高糖環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞的保護作用并改善損傷顯得尤為重要。為此，我們通過實驗發(fā)現(xiàn)：EGCG對高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷提供了較為積極的保護作用，Sirt-1介導(dǎo)了這種保護作用。

EGCG是綠茶多酚的活性成分，既往研究表明其具有強大的抗氧化作用[2]，保護細(xì)胞的DNA免受損害，同時在心腦血管、神經(jīng)保護方面發(fā)揮了積極的作用，機制涉及抗氧化應(yīng)激，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[1]等；此外，還有研究表明，EGCG具有抗病毒[6]、抗炎、抑制腫瘤[7]等功效，機制涉及抑制腫瘤相關(guān)酶的活性從而抑制增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等。

為明確高糖微環(huán)境對神經(jīng)細(xì)胞的損傷及EGCG提供的保護作用，我們使用PC12細(xì)胞模擬神經(jīng)細(xì)胞，PC12來源于小鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，具有類神經(jīng)細(xì)胞的生物特性及分泌能力，是神經(jīng)病理生理研究公認(rèn)的理想實驗對象[8]。我們采用不同濃度的葡萄糖(15、 30、 45 mmol/L)處理PC12細(xì)胞，通過檢測細(xì)胞活力，凋亡保護蛋白Bcl-2的表達(dá)客觀評估細(xì)胞的存活情況；Caspase3在胞質(zhì)內(nèi)被磷酸化，活化后的Caspase3通過對DNA修復(fù)酶的剪切啟動細(xì)胞的凋亡程序，是公認(rèn)為評估凋亡的可靠指標(biāo)[9]，我們采用免疫熒光法分別標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)內(nèi)活化的Caspase3以及胞核內(nèi)DAPI的表達(dá)，以直觀地感受細(xì)胞凋亡發(fā)生時，凋亡相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)強度。結(jié)果表明高糖微環(huán)境誘導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。接下來，我們通過加入EGCG，并與損傷組相比較來評估其提供的神經(jīng)細(xì)胞保護作用，同樣通過檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)EGCG對高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡提供了較為可觀的保護作用，與我們的預(yù)期相一致。

此外，我們進一步探討了Sirt-1在細(xì)胞保護中的介導(dǎo)作用。Sirt-1被許多科學(xué)家稱為“長壽基因”，正是由于其參與了細(xì)胞的分化、代謝，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞壽命，并決定了細(xì)胞的存活[10]。有研究證實：Sirt-1在許多神經(jīng)退行性變中扮演了保護者的角色[11]。在我們的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)EGCG不僅具有提升Sirt-1的表達(dá)、逆轉(zhuǎn)高糖對Sirt-1的抑制作用，而且使用Sirt-1特異性阻滯劑Sirtinol后，EGCG的保護作用被逆轉(zhuǎn)，這些都表明，Sirt-1介導(dǎo)了EGCG對PC12細(xì)胞的保護作用。此外，單獨使用Sirtinol對細(xì)胞活力也產(chǎn)生了輕微的抑制作用，具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Sirt-1可能還通過其他通路介導(dǎo)和發(fā)揮了細(xì)胞的保護作用。然而，EGCG對高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的損傷的更深入的機制，以及其他應(yīng)激及保護方面的研究仍需進一步探索。

通過實驗，我們證實EGCG能夠通過Sirt-1的介導(dǎo)從而提供對高糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護作用，這為高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)病變提供了新的思路?；谖覀兊难芯浚\用EGCG為神經(jīng)病變提供保護或許是新的策略與方法，也為神經(jīng)系統(tǒng)病變的治療提供了新的視角。