模擬溶出法研究袋裝口含煙煙堿口腔釋放規(guī)律

王超，楊繼，楊柳，段沅杏，趙楊，趙輝，吳俊，鞏效偉，陳永寬

1 湘潭大學(xué)化學(xué)學(xué)院，湖南 湘潭 411105;

2 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市北市區(qū)紅錦路367號(hào) 650231

無(wú)煙氣煙草制品[1]（Smokeless tobacco products，STPs），是一種以非抽吸方式使用的煙草制品，通過(guò)口含、吸吮、咀嚼等方式向人體提供尼古丁。產(chǎn)品包括袋裝口含煙、鼻煙和嚼煙等多種多樣的形式。袋裝口含煙是具有一定顆粒度的煙草粉末混合適量的香味物質(zhì)、矯味劑、水、保潤(rùn)劑和酸堿調(diào)節(jié)劑經(jīng)熱處理加工制成的，用無(wú)紡布小袋包裝，置于唇齒之間消費(fèi)[2]，目前市場(chǎng)上袋裝口含煙產(chǎn)品主要以Snuff（美國(guó)）和Snus（瑞典）兩種為主。2017年，袋裝口含煙銷量約7萬(wàn)噸，主要在美國(guó)、瑞典、挪威、阿爾及利亞、突尼斯、加拿大、捷克等國(guó)家銷售。其中，美國(guó)市場(chǎng)的袋裝口含煙約占全球總銷量的80%，銷售額近120億美元[3]。通過(guò)STPs形式進(jìn)行消費(fèi)時(shí)，煙草不經(jīng)燃燒，不會(huì)產(chǎn)生卷煙煙氣，更無(wú)“二手煙”，是控?zé)煭h(huán)境下煙草消費(fèi)的重要補(bǔ)充形式。受到當(dāng)前世界控?zé)熯\(yùn)動(dòng)的影響，STPs正成為國(guó)際煙草領(lǐng)域的重要發(fā)展趨勢(shì)。

煙草中生物堿約有50種，其中煙堿約占95%以上[4]。煙堿是STPs的重要成分，主要通過(guò)口腔或鼻腔粘膜吸收，作用于人體神經(jīng)系統(tǒng)使吸食者產(chǎn)生滿足感[5]。煙堿釋放量是STPs的重要指標(biāo)。Rickert等[6]分析了加拿大市場(chǎng)7種類型、30個(gè)品牌的STPs中的煙堿含量，結(jié)果表明：從美國(guó)進(jìn)口的Fine cut moist snuff類型口含煙中煙堿平均含量最高，達(dá)30.2 mg/g。袋裝口含煙中煙堿的溶出規(guī)律研究及質(zhì)量評(píng)價(jià)通常通過(guò)人群實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，但人群實(shí)驗(yàn)受到倫理、社會(huì)等諸多因素的限制，且個(gè)體因素影響較大，較難推廣。目前，有不少關(guān)于模擬咀嚼裝置的報(bào)道[7-13]。張文娟等[7]開(kāi)發(fā)一種用于體外評(píng)價(jià)膠基型STPs煙堿釋放行為的模擬咀嚼機(jī)，該裝置利用循環(huán)水箱和載物臺(tái)形成的腔，模擬人體口腔，測(cè)試時(shí)將煙草制品放在里面，利用空氣壓縮機(jī)帶動(dòng)氣動(dòng)夾子反復(fù)擠壓被測(cè)樣品以模擬人體咀嚼狀態(tài)，并結(jié)合高效液相色譜儀檢測(cè)煙堿含量。該裝置能較好地模擬膠基型STPs煙堿釋放行為且方法簡(jiǎn)便可靠，測(cè)試結(jié)果與人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。該技術(shù)對(duì)STPs質(zhì)量控制、煙堿生物利用度評(píng)價(jià)以及煙堿調(diào)控具有一定的應(yīng)用價(jià)值，但不足之處是不能調(diào)節(jié)咀嚼頻率和咀嚼力度，不能較為真實(shí)地反映人們吸食袋裝口含煙的口腔狀況。Luque-Pérez等[10]設(shè)計(jì)了一種支撐液膜結(jié)合紫外分光光度計(jì)檢測(cè)煙堿的釋放量的裝置，該裝置是將煙草制品放在支撐液膜中，然后在受體流中測(cè)量釋放的尼古丁。此方法雖然能達(dá)到檢測(cè)目的，但是受限較多，且穩(wěn)定性差。張杰等[13]開(kāi)發(fā)了一套能夠模擬STPs煙堿在口腔釋放的體外釋放裝置。該裝置是利用恒溫溶出池來(lái)模擬人體口腔，將口含煙放在其中，然后通過(guò)恒流泵、恒溫槽、預(yù)熱線圈、保溫管、恒溫溶出池使煙堿在模擬條件下釋放，最后收集不同時(shí)間點(diǎn)的釋放液，通過(guò)HPLC測(cè)定煙堿含量。該裝置操作方便、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好，能夠較好的模擬口含型STPs在口腔的釋放行為，對(duì)口含型STPs的質(zhì)量評(píng)價(jià)、研發(fā)、生產(chǎn)等具有一定的實(shí)用價(jià)值，但不足之處是在實(shí)驗(yàn)時(shí)不能考察壓力因素對(duì)煙堿釋放的影響。上述報(bào)道是在固定唾液流速或唾液量下探究不同類型STPs煙堿體外釋放情況，而沒(méi)有考察壓力因素和唾液流速對(duì)煙堿釋放的影響[1]。為克服以上缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了一種新型口腔模擬溶出裝置，基于此建立了一種可控性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的袋裝口含煙煙堿體外模擬溶出研究方法，并對(duì)不同類型袋裝口含煙的煙堿溶出率進(jìn)行了比較，可為袋裝口含煙產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：調(diào)研收集4種具有代表性的市售袋裝口含煙和1種自制袋裝口含煙。

市售袋裝口含煙： ETTAN（購(gòu)于瑞典），用于自愿者體內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn)，以確定模擬溶出實(shí)驗(yàn)的設(shè)備條件。產(chǎn)品1袋裝口含煙（購(gòu)于瑞典）；產(chǎn)品2散裝口含煙（購(gòu)于美國(guó)）；產(chǎn)品3內(nèi)裝煙堿復(fù)合鹽型袋裝口含煙（購(gòu)于瑞典）；產(chǎn)品4為自制袋裝口含煙。5種產(chǎn)品的煙堿含量實(shí)測(cè)值見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

試劑：煙堿（＞98%，加拿大TRC試劑公司）；甲醇（色譜純，默克股份有限公司）；氯化鎂（AR，上海麥克林生化科技有限公司）；磷酸氫二鈉（AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；碳酸氫鉀（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鈣、一水合檸檬酸（AR，西隴化工股份有限公司）。

儀器：Puff Man 模擬溶出儀（上海帕夫曼自動(dòng)化儀器有限公司）；Waters ACQUITY超高效色譜儀（美國(guó)：Waters公司）；PHS-3C型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q50超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；XP504 型電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；13 mm×0.45 μm水相針式濾器（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；HY-8調(diào)速振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙堿含量測(cè)定

參照Garg[14]的測(cè)試方法測(cè)定袋裝口含煙中的煙堿。測(cè)試時(shí)取1粒樣品，準(zhǔn)確稱重，用剪刀剪開(kāi)后放入錐形瓶，加入20 mL磷酸鹽緩沖液和2 mL鹽酸水溶液（0.25 mol/mL），先超聲40min然后再在震蕩器上振蕩30～60 min。取下錐形瓶，靜置，過(guò)濾萃取液，最后使用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，使用反相超高效液相色譜（RP-HPLC）定量分析。色譜條件如下：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇和磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH=6.80），其比例為65：35；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：UV；檢測(cè)波長(zhǎng)：259 nm。

1.2.2 口腔模擬溶出基準(zhǔn)參數(shù)選擇

選取具有代表性（青年和中年，男性和女性）的7名25～35周歲的健康志愿者（5男2女）進(jìn)行煙堿體內(nèi)溶出實(shí)驗(yàn)，志愿者基本信息如表2所示，志愿者均來(lái)自云南中煙品吸委員會(huì)，在吸食產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)的同時(shí)，采集其不同時(shí)間點(diǎn)唾液和殘留樣品進(jìn)行測(cè)定，對(duì)此實(shí)驗(yàn)可能所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)已告知志愿者并征得其同意。

表2 志愿者基本信息表Tab.2 Basic information of volunteers

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前對(duì)樣品進(jìn)行稱重，選取質(zhì)量為（0.86±0.005）g樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。志愿者在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)遵循以下條件：①實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30 min內(nèi)不使用與煙草相關(guān)的任何產(chǎn)品；②實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需用純凈水漱口；③樣品放入唇齒間立刻計(jì)時(shí)；④實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不能吃食物、喝水或頻繁講話，唾液吐到相應(yīng)的收集瓶中；⑤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到一定的時(shí)間后殘留樣品放入相應(yīng)的收集瓶中。選取市售口含煙（ETTAN，購(gòu)于瑞典）分別測(cè)定7名志愿者在自然狀態(tài)下口含0～0.5、0～1、0～2、0～5、0～10、0～15和0～20 min之后殘留樣品并收集各個(gè)時(shí)間段志愿者唾液。采用1.2.1方法測(cè)定殘留樣品中的煙堿含量。然后根據(jù)公式（1）計(jì)算出志愿者煙堿溶出量，并根據(jù)Grubbs檢驗(yàn)法剔除異常值。最終以其平均值作為校正口腔模擬溶出參數(shù)的依據(jù)。

其中，M1-煙堿溶出量，μg；

M0-樣品實(shí)測(cè)煙堿含量均值，μg；

M2-殘留樣品中煙堿含量，μg。

1.2.3 體外模擬溶出實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前將配制好的人工唾液加入儲(chǔ)液瓶中，置于恒溫水浴鍋內(nèi)恒溫至37℃。開(kāi)機(jī)設(shè)定模擬口腔溫度為37℃，設(shè)定模擬溶出裝置參數(shù)，將待測(cè)試的口含煙放入模擬口腔內(nèi)，在電機(jī)的帶動(dòng)下人工齒下降壓住口含煙模擬人體吸食，到達(dá)預(yù)先設(shè)置的條件后，立即取出殘留樣品。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用一?？诤瑹?，分別收集0～0.5、0～1、0～2、0～5、0～10、0～15和0～20 min時(shí)殘留樣品，采用1.2.2所示公式和1.2.1所示方法測(cè)定其煙堿含量。每次實(shí)驗(yàn)完成后，模擬口腔相關(guān)組件需用人工唾液清洗干凈方可進(jìn)行下一組實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 模擬溶出溫度的確定

人體口腔溫度一般在37℃左右[15]，實(shí)驗(yàn)時(shí)選37℃來(lái)模擬口腔溫度，人工唾液通過(guò)恒溫加熱器加熱至37℃。

2.1.1 人工唾液配方和各時(shí)間段用量的確定

唾液由口腔腮腺、下頜下腺等分泌的混合產(chǎn)物，其成分比較復(fù)雜。主要包括水分、無(wú)機(jī)鹽和各種蛋白，其中水分含量最高，約占其99%，在未接受刺激的條件下pH為6.71～6.90[16-17]。目前人工唾液主要分為純無(wú)機(jī)鹽溶液和帶有蛋白酶等具有生物活性的無(wú)機(jī)鹽溶液兩大類[18]。且有研究表明是否帶有蛋白酶等具有生物活性的人工唾液對(duì)煙堿的釋放影響不大[12]。本實(shí)驗(yàn)的體外溶出介質(zhì)選用Morjaria等[19]介紹的一種歐洲藥典收錄的模擬咀嚼裝置時(shí)使用的人工唾液，配方如表3所示。

表3 人工唾液配方Tab.3 The formula of artificial saliva

使用口含煙時(shí)的唾液分泌量因年齡、刺激強(qiáng)度、實(shí)驗(yàn)采集方法和人種等因素而不同。Dawes等[20]收集了24名年輕人在不同場(chǎng)合咀嚼6種口香糖時(shí)分泌的唾液量數(shù)據(jù)，表明在咀嚼口香糖口腔受到刺激時(shí)，唾液分泌速度在第1 min達(dá)到峰值，隨后隨著刺激的降低唾液分泌速度下降。Polland等[21]研究了90 min內(nèi)持續(xù)咀嚼薄荷風(fēng)味口香糖的結(jié)果表明：體內(nèi)唾液流速在2 min時(shí)出現(xiàn)峰值（2.57±0.7 mL/min），唾液的平均流速范圍從0.88 mL/min（20 min內(nèi)）到0.55 mL/min。參考上述結(jié)果，并通過(guò)本實(shí)驗(yàn)收集到的志愿者數(shù)據(jù)，確定各時(shí)間段人工唾液加入量如表4所示。

使用口含煙時(shí)的唾液分泌量因年齡、刺激強(qiáng)度、實(shí)驗(yàn)采集方法和人種等因素而不同。Dawes等[20]收集了24名年輕人在不同場(chǎng)合咀嚼6種口香糖時(shí)分泌的唾液量數(shù)據(jù)，表明在咀嚼口香糖口腔受到刺激時(shí)，唾液分泌速度在第1 min達(dá)到峰值，隨后隨著刺激的降低唾液分泌速度下降。Polland等[21]研究了90 min內(nèi)持續(xù)咀嚼薄荷風(fēng)味口香糖的結(jié)果表明：體內(nèi)唾液流速在2 min時(shí)出現(xiàn)峰值（2.57±0.7 mL/min），唾液的平均流速范圍從0.88 mL/min（20 min內(nèi)）到0.55 mL/min。參考上述結(jié)果，并通過(guò)本實(shí)驗(yàn)收集到的志愿者數(shù)據(jù)，確定各時(shí)間段人工唾液加入量如表4所示。

表4 唾液量對(duì)比表Tab.4 comparison of saliva amount

2.1.2 模擬溶出壓合力的確定

口含煙在消費(fèi)時(shí)受到一定的壓力。艾明歡等[22]設(shè)計(jì)了透皮擴(kuò)散池與豬口腔黏膜配套裝置，結(jié)合高效液相色譜（HPLC）法，研究了口含型無(wú)煙氣煙草制品煙堿在口腔黏膜中不同條件下的滲透行為，結(jié)果表明：壓力明顯影響煙堿的滲透速率。本裝置通過(guò)更換不同重量的砝碼達(dá)到不同的壓合力。以志愿者吸食的ETTAN口含煙中煙堿的體內(nèi)溶出量M1值為校正目標(biāo)，先確定壓合力度不變，改變模擬溶出唾液加入量對(duì)煙堿含量進(jìn)行體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)對(duì)比，以確定唾液量；15～20分鐘后，由于煙堿溶出已較多，消費(fèi)者習(xí)慣性會(huì)增加壓合力度，以獲得持續(xù)的生理滿足感，且實(shí)驗(yàn)中在確定了唾液量的基礎(chǔ)上，調(diào)整了不同的壓合力以使體內(nèi)外煙堿溶出量盡量一致，實(shí)驗(yàn)參數(shù)調(diào)整如表5所示。

表5 體內(nèi)外煙堿溶出量參數(shù)調(diào)整表Tab.5 Parameter adjustment of nicotine dissolution in vitro and in vivo

最終確定的體外模擬溶出參數(shù)如表6所示，煙堿的體內(nèi)和體外溶出趨勢(shì)圖如圖1所示。由圖1可以看出，煙堿的體內(nèi)體外溶出曲線趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明該方法能很好地模仿袋裝口含煙中煙堿的體內(nèi)溶出規(guī)律。

表6 袋裝口含煙煙堿模擬溶出參數(shù)Tab.6 Simulated dissolution parameters of nicotine in pouched smokeless tobacco product

圖1 口含型無(wú)煙氣煙草制品中煙堿的體內(nèi)和體外溶出趨勢(shì)Fig.1 In vivo and in vitro release trend of nicotine in oral smokeless tobacco product

2.2 模擬溶出裝置參數(shù)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以志愿者吸食的ETTAN為樣品，使用模擬溶出裝置按照上述模擬溶出參數(shù)進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，重復(fù)4次以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來(lái)判斷模擬溶出裝置及參數(shù)的穩(wěn)定性。由表7可知，實(shí)驗(yàn)樣品的RSD范圍為2.11%～5.03%，表明方法的結(jié)果較可靠，對(duì)該類產(chǎn)品的體外溶出研究有一定參考價(jià)值。

表7 模擬咀嚼溶出參數(shù)穩(wěn)定性Tab.7 Parameter stability of buccal cavity simulator

2.3 典型實(shí)驗(yàn)樣品的模擬溶出實(shí)驗(yàn)

利用上述方法測(cè)試市場(chǎng)上代表性袋裝口含煙產(chǎn)品和自主開(kāi)發(fā)產(chǎn)品，結(jié)果如表8和圖2。由表8和圖2可以看出4種典型口含煙的煙堿溶出呈現(xiàn)先快后慢的趨勢(shì)，產(chǎn)品1和產(chǎn)品4煙堿溶出顯著低于另外兩款產(chǎn)品。在20 min時(shí)所有產(chǎn)品煙堿溶出量都能達(dá)到60%，產(chǎn)品3煙堿溶出量最高為80%。

對(duì)比四種產(chǎn)品可知，不同類型口含煙煙堿溶出率也不盡相同。自制袋裝口含煙和國(guó)外進(jìn)口袋裝口含煙有相似的溶出規(guī)律，和產(chǎn)品二（散裝口含煙）對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)無(wú)紡布對(duì)煙堿溶出有一定的阻礙作用，煙堿復(fù)合鹽型袋裝口含煙具有最高的煙堿溶出率。

表8 典型實(shí)驗(yàn)樣品模擬溶出數(shù)據(jù)表Tab.8 Simulated dissolution data of typical experimental samples

圖2 典型實(shí)驗(yàn)樣品中煙堿體外溶出率Fig.2 In vitro dissolution rate of nicotine in typical experimental samples

3 結(jié)論

利用新型模擬口腔裝置以人工齒模擬人口腔牙齒，以人工舌模擬人口腔舌頭，以裝置口腔模擬人口腔，經(jīng)過(guò)對(duì)溫度、唾液流速、唾液加入量和口腔壓力的調(diào)節(jié)建立了一種可控、可靠的煙堿體外模擬溶出研究方法，該方法能比較真實(shí)的模擬口含煙在口腔中的消費(fèi)條件，且能很好地模仿口袋裝口含煙中煙堿的體內(nèi)溶出規(guī)律，具有操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。采用建立的方法測(cè)定了主流的口含煙樣品，試驗(yàn)數(shù)據(jù)符合產(chǎn)品類型特點(diǎn)，進(jìn)一步證明了方法的可行性。因此，該模擬溶出法能為袋裝口含煙的加工制作及質(zhì)量評(píng)價(jià)等提供良好的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。