基于疊氮基-氰基點(diǎn)擊化學(xué)的苯硼酸親和硅膠的制備及其在糖蛋白/糖肽選擇性富集中的應(yīng)用

張麗媛, 王立恒, 王麗莉, 董佩佩, 劉和真, 趙艷艷*

(1. 大連醫(yī)科大學(xué), 遼寧 大連 116044; 2. 大連市第二人民醫(yī)院骨科康復(fù)中心, 遼寧 大連 116001)

蛋白質(zhì)的糖基化是最重要的翻譯后修飾之一,其在細(xì)胞表面識別、免疫應(yīng)答、蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)傳導(dǎo)等生物轉(zhuǎn)化過程中都起著重要的作用[1]。因此,糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究在生物學(xué)和臨床應(yīng)用中都扮演重要角色[2,3]。然而,糖蛋白在生物樣品中豐度較低,在質(zhì)譜檢測時容易被其他非糖蛋白抑制,因此需發(fā)展高效的糖肽/糖蛋白的分離富集方法以提高糖肽/糖蛋白的鑒定效率。

目前糖肽/糖蛋白的分離富集方法主要有凝集素親和法[4]、肼化學(xué)法[5]、親水相互作用法[6]、硼親和色譜法[7,8]、體積排阻法[9]等,這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。其中硼親和色譜法富集糖肽/糖蛋白的原理是通過調(diào)節(jié)溶液的pH值使硼親和材料上的硼酸基團(tuán)與糖的1,2-順式二羥基產(chǎn)生可逆結(jié)合,堿性條件下結(jié)合,酸性條件下解離,上樣富集條件的pH值對糖肽/糖蛋白的保留起到重要的作用[10,11]。硼親和色譜法具有顯著的優(yōu)勢,如操作簡單、富集無偏向性、重現(xiàn)性好。新型硼酸親和材料的開發(fā)作為硼親和色譜法的核心領(lǐng)域,引起研究者極大的重視?，F(xiàn)有的方法[7,8]大多在追求高糖蛋白/糖肽富集選擇性的同時,兼顧生物相容性,合成操作簡便。

“點(diǎn)擊化學(xué)”在諸多領(lǐng)域得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用,特點(diǎn)是選擇性高、轉(zhuǎn)化率高、條件溫和[12,13]。目前應(yīng)用最多的“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)是疊氮-炔基加成反應(yīng)(CuAAC)[14]。然而,CuAAC反應(yīng)使用Cu(I)作為催化劑,殘留的重金屬Cu會帶來生物毒性,從而限制了這種反應(yīng)的應(yīng)用。無銅催化的“點(diǎn)擊化學(xué)”疊氮基-氰基加成反應(yīng)[15,16]不僅操作簡單、反應(yīng)高效,而且避免了CuAAC反應(yīng)由重金屬Cu帶來生物毒性的問題,生物相容性好,適用于硼酸親和材料的制備。相比較另一種比較熱門的無銅催化“點(diǎn)擊化學(xué)”方法(巰基-炔基點(diǎn)擊化學(xué)法)[17],疊氮基-氰基點(diǎn)擊化學(xué)法具有一個顯著的優(yōu)勢,即四唑基團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)物的形成。四唑基團(tuán)能夠提供親水作用力,因此,采用疊氮基-氰基點(diǎn)擊化學(xué)法合成的硼親和材料不僅能夠提供硼酸親和作用力,而且能夠提供親水作用力。糖蛋白和糖肽在硼酸親和作用力和親水作用力下的保留均強(qiáng)于它們的對應(yīng)物,因此,采用疊氮基-氰基點(diǎn)擊化學(xué)法合成的硼親和材料有望具備較強(qiáng)的糖蛋白和糖肽的富集選擇性。然而目前沒有采用基于疊氮基-氰基點(diǎn)擊化學(xué)法合成硼親和材料的報道,有必要將此合成方法應(yīng)用到硼親和材料的制備合成中去。就硼親和材料的基質(zhì)而言,常用的基質(zhì)有磁珠[17,18]、聚合物整體柱[19-21]、分子印跡聚合物[22]、納米顆粒[23-25]、金屬氧化物[26]等。相比較其他類型基質(zhì),硅膠是高效液相色譜載體最常用的基質(zhì)類型,具有更為實(shí)用的應(yīng)用價值,在大規(guī)模糖蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用研究前景較好。因此,開發(fā)生物相容性好、鍵合量高、制備方法簡便的硅膠基質(zhì)硼酸親和材料十分有必要。

本研究基于疊氮基-氰基無銅催化的“點(diǎn)擊”化學(xué)反應(yīng),制備了一種以硅膠為基質(zhì)的新型苯硼酸親和硅膠(TCNBA)材料,將4-氰基苯硼酸鍵合到疊氮基修飾的硅膠表面。利用紅外光譜和X射線光電子能譜對材料進(jìn)行表征以確定鍵合反應(yīng)成功。在優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上,以辣根過氧化物酶(HRP)、免疫球蛋白G(IgG)、核糖核酸酶B(RNaseB)、牛血清白蛋白(BSA)為對象,分別考察材料對糖肽和糖蛋白的富集選擇性。并將TCNBA應(yīng)用于實(shí)際樣品人血清中糖蛋白的選擇性富集。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultraflex III MALDI-TOF/TOF MS(德國Bruker Daltonics公司); SDS(十二烷基磺酸鈉)凝膠電泳槽(北京市六一儀器廠);紅外光譜采用Nicolet 20 DXB FT-IR儀器(美國Nicolet公司)進(jìn)行測試、X射線光電子能譜圖采用ESCALAB 250Xi(美國Thermo Fisher公司)進(jìn)行測試。

疊氮基硅膠(實(shí)驗(yàn)室自制,制備方法參照文獻(xiàn)[27]); 4-氰基苯硼酸(純度99%)、碳酸氫銨(化學(xué)純)、醋酸亞鐵(純度99%)、三氟乙酸(質(zhì)譜純)、甲酸(質(zhì)譜純)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF,化學(xué)純)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2,化學(xué)純)均購買自百靈威科技有限公司(北京);冰醋酸(化學(xué)純)、甲醇(化學(xué)純)、乙醇(化學(xué)純)均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙腈(ACN,質(zhì)譜純)購自德國Darmstadt公司; HRP、IgG、RNaseB、BSA、二硫蘇糖醇(DTT,質(zhì)譜純)、尿素(質(zhì)譜純)、碘乙酰胺(IAA,質(zhì)譜純)、2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB,質(zhì)譜純)均購自美國Sigma公司;胰蛋白酶購自美國Promega公司;正常人血清、考馬斯亮藍(lán)(R-250)均購自北京索萊寶科技有限公司。文中溶液配制比例,除特別說明外,均為體積比。

1.2 TCNBA的制備

TCNBA合成反應(yīng)如圖1所示,操作過程如下:稱取0.5 g疊氮基硅膠,與10 mL含0.25 g 4-氰基苯硼酸的DMF/甲醇(9∶1, v/v)溶液混合,混懸均勻后,加入30 mg醋酸亞鐵,在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下,于80 ℃持續(xù)攪拌反應(yīng)24 h。將反應(yīng)體系冷卻至室溫后,依次用EDTA-Na2/H2O(1∶9,質(zhì)量比)、水、甲醇各洗滌3次,于50 ℃干燥過夜,即得TCNBA。

圖 1 TCNBA材料的合成方法Fig. 1 Triazo-cyanide boronic acid functionalized material (TCNBA) synthesis methodDMF: N,N-dimethylformamide; MeOH: methanol.

1.3 糖肽富集

1.3.1蛋白質(zhì)酶解

稱取0.5 mg HRP溶于100 μL含有8 mol/L尿素的50 mmol/L碳酸氫銨緩沖溶液中,于56 ℃反應(yīng)10 min。加入20 μL 100 mmol/L DTT溶液,于56 ℃反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后,將5 μL 50 mmol/L IAA溶液加入到混合物中,常溫避光孵育30 min。將5 mmol/L碳酸氫銨溶液與胰蛋白酶以40∶1(m∶m)的比例混合,于37 ℃中孵育16 h。所得的溶液冷卻到室溫后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。糖肽富集所用的IgG、RNaseB、BSA的酶解物均用此種方法酶解。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白酶解物的富集

稱取2 mg TCNBA,加入200 μL 80%(體積分?jǐn)?shù),下同)ACN溶液,使其成為均勻的混懸液(10 g/L)。取50 μL的混懸液與酶解物混合,加入200 μL 80% ACN/NH3H2O溶液(pH 11),室溫下渦旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度離心5 min后,棄除上清液;重復(fù)加液洗滌一次。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脫,以10 000 r/min的速度離心5 min后,取上清液冷凍干燥。干燥后,加入2 μL基質(zhì)溶液(含25 g/L 2,5-DHB的70%ACN/1%FA溶液)溶解后點(diǎn)樣,進(jìn)行MALDI-TOF MS分析(設(shè)置線性正離子模式及延遲離子提取方法,延遲時間為90 ns,提取電壓為20 kV,每個質(zhì)譜圖由30個激光點(diǎn)的結(jié)果加和得到)。HRP、RNaseB、IgG的酶解物均用此種方法富集。

1.3.3糖蛋白與非糖蛋白酶解液混合物的富集

取50 μL的TCNBA混懸液與5 μL HRP∶BSA=1∶10(物質(zhì)的量比)蛋白質(zhì)酶解液混合,加入200 μL80%ACN/NH3H2O溶液(pH=11),室溫下渦旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度離心5 min后,去除上清液;重復(fù)加液洗滌一次。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脫,以10 000 r/min的速度離心5 min后,取上清液冷凍干燥。干燥后,加2 μL的基質(zhì)溶液溶解,進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。

1.4 糖蛋白富集

1.4.1糖蛋白與非糖蛋白混合物富集

取3個分別裝有50 μL TCNBA混懸液的Eppendorf離心管,依次加入物質(zhì)的量比為HRP∶BSA=1∶1、HRP∶BSA=1∶10、HRP∶BSA=1∶20的蛋白質(zhì)混合溶液進(jìn)行上樣。然后分別加入200 μL 80%ACN/NH3H2O溶液(pH=11),室溫下渦旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度離心5 min后,棄去上清液。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脫,以10 000 r/min的速度離心5 min,將所得的洗脫液冷凍干燥,然后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)試驗(yàn)。IgG、RNaseB與BSA混合物中的糖蛋白均用此方法富集。

1.4.2多種糖蛋白與非糖蛋白混合物富集

取50 μL TCNBA混懸液,等摩爾依次加入HRP、IgG、RNaseB、BSA的蛋白質(zhì)溶液混合,再加入200 μL 80%ACN/NH3H2O溶液(pH=11),室溫下渦旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度離心5 min后,棄去上清液,重復(fù)加液洗滌一次。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脫,以10 000 r/min的速度離心5 min,將所得的洗脫液冷凍干燥,然后進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)。

1.4.3實(shí)際樣品中糖蛋白富集

取50 μL TCNBA混懸液與5 μL正常人血清混合,加入200 μL 80%ACN/NH3H2O溶液(pH=11),室溫下渦旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度離心5 min,去除上清液,重復(fù)加液洗滌一次。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脫,室溫下渦旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度離心5 min,將所得的洗脫液冷凍干燥,然后進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 TCNBA的表征

基于疊氮基-氰基的“點(diǎn)擊”化學(xué)法反應(yīng)過程如圖1所示,4-氰基苯硼酸在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下,以醋酸亞鐵作為催化劑,鍵合到疊氮基硅膠表面。

圖 2 疊氮基硅膠和TCNBA的紅外圖譜Fig. 2 IR spectra of azide modified silica gel and TCNBA

將所制備得到的TCNBA進(jìn)行紅外光譜法表征,通過材料合成前后紅外光譜吸收峰信息的變化來判斷材料是否成功合成。結(jié)果如圖2所示,在疊氮基硅膠和TCNBA中,3 380 cm-1附近的吸收峰增強(qiáng),為4-氰基苯硼酸表面-OH的振動;在1 638 cm-1處的吸收峰為苯環(huán)雙鍵區(qū)的振動,苯環(huán)的吸收峰增強(qiáng),表明4-氰基苯硼酸已經(jīng)鍵合到疊氮基硅膠上。同時在TCNBA中的1 335 cm-1處為B-O吸收峰,進(jìn)一步的表明了材料表面成功的鍵合上硼酸基團(tuán)。結(jié)果表明TCNBA制備成功。

為了更好地驗(yàn)證硼酸已經(jīng)被成功地鍵合到材料表面,進(jìn)行了X射線光電子能譜表征試驗(yàn),對材料表面硼元素進(jìn)行能級譜掃描。如圖3所示,191 eV處出現(xiàn)了硼元素的能譜峰(能譜峰定性數(shù)據(jù)來自于NIST X-ray Photoelectron Spectroscopy Database)。結(jié)果表明,材料合成成功,4-氰基苯硼酸已成功鍵合到疊氮基硅膠表面。

圖 3 TCNBA的X射線光電子能譜圖Fig. 3 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spectrum of TCNBA

2.2 TCNBA用于糖肽富集

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白酶解物的富集

為了考察TCNBA的糖肽富集選擇性,本研究選取了兩種標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白,HRP和IgG的胰蛋白酶酶解物作為研究對象。首先對TCNBA的糖肽富集條件進(jìn)行了優(yōu)化,硼酸基團(tuán)能夠在堿性條件下和糖肽上的糖基結(jié)合,在酸性條件下解離。此外,硼酸上的羥基能夠提供氫鍵作用力,因此條件優(yōu)化過程中同時考慮硼酸親和作用力和氫鍵作用力的特點(diǎn)。優(yōu)化后的上樣和孵育條件為高有機(jī)相堿性條件,洗脫條件為低有機(jī)相酸性條件。

圖 4 HRP和IgG酶解液用TCNBA富集前后的MALDI-TOF MS圖譜Fig. 4 MALDI-TOF MS spectra of the tryptic digestion of horse radish peroxidase and immunoglobulin G (IgG)The glycopeptide signals were all marked with m/z, and the non-glycopeptide signals were not marked with m/z.

m/zGlycan structureAmino acid sequenceBefore enrichmentAfter enrichment1021GlcNAc1Fuc1NVGLNR√1843Man3GlcNAc2Fuc1Xyl1NVGLNR√2218Man3GlcNAc2Fuc1LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR√2508GlcNAcFucGlcNAcMan3XylASILLDN#TTSFR√2612Man3GlcNAc2Fuc1Xyl1MGNITPLTGTQGQIR√3146[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1GLCPLNGN#LSALVDFDLR. Oxide√√3322[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1QLTPTFYDNSCPN#VSNIVR√3354[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1SFAN#STQTFFNAFVEAMDR√√3607[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1NQCRGLCPLNGN#LSALVDFDLR√3672[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1GLIQSDQELFSSPN#ATDTIPLVR√√3896[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1LHFHDCFVNGCIASILLDN#TTSFR√√4057[Hex]3[HexNAc]2[Xyl]1QLTPTFYDNSC(AAVESACPR)PN#VSNIVR-H2O√4222[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1QLTPTFYDNSC(AAVESACPR)PN#VSNIVR√4986[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1LYN#FSNTGLPDPTLN#TTYLQTLR√√

The structure information is taken from the literature[29]. GlcNAc:N-acetylglucosamine; Fuc: fucose; Man: mannose; Xyl: xylose; Hex: hexose; HexNAc:N-acetylhexosamine. #: glycosylation sites; √: observed signals.

采用MALDI-TOF MS對糖肽進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白HRP和IgG的酶解液為分析對象來考察TCNBA對糖肽的選擇性與富集效果。富集方法見1.3.2節(jié)。HRP糖肽為復(fù)合型糖鏈,主要包含9個潛在的糖基化位點(diǎn),HRP酶解物在富集前只檢測到了5個糖肽(m/z3 146、3 354、3 672、3 896、4 986,見圖4a和表1),而經(jīng)材料富集后不僅檢測到了13個糖肽(m/z1 021、1 843、2 218、2 508、2 612、3 322、3 354、3 607、3 672、3 896、4 057、4 222、4 986,見圖4b),而且去除了大部分非糖肽雜質(zhì)的干擾。IgG糖肽主要含有中性糖的復(fù)合型糖鏈,在富集前質(zhì)譜分析只檢測出了3個微弱的糖肽信號(m/z2 286、2 602、2 763,見圖4c和表2),而經(jīng)材料富集后檢測到了11個糖肽(m/z2 286、2 456、2 602、2 635、2 763、2 797、2 838、2 927、2 958、3 000、3 250,見圖4d),并且去除了大部分非糖肽雜質(zhì)的干擾。結(jié)果表明,TCNBA對糖肽具有較好的選擇性和富集效果,糖肽信號強(qiáng)度得到較大程度增強(qiáng),并且去除了大部分非糖肽雜質(zhì)的干擾。TCNBA從HRP酶解液中富集的糖肽數(shù)量相比文獻(xiàn)[27]報道的其他材料富集結(jié)果有一定差距,這是因?yàn)門CNBA所采用的是苯硼酸功能基團(tuán),其對于糖肽富集選擇性要弱于文獻(xiàn)中所采用的苯并硼氧醇功能基團(tuán)[28]。盡管如此,所制備的TCNBA具有較好的糖肽富集選擇性,對于HRP和IgG的蛋白酶解液的富集效果是顯而易見的,這是由于材料不僅能夠提供硼酸親和作用力,而且能夠提供氫鍵作用力和靜電作用力。疊氮硅膠和氰基苯硼酸反應(yīng)后生成的四唑基團(tuán)是親水作用力增強(qiáng)的原因。整個制備中沒有采用重金屬,生物相容性好,操作簡便,這些也成為TCNBA作為糖肽選擇性富集材料的優(yōu)勢。

表 2 經(jīng)TCNBA富集后免疫球蛋白G(IgG)酶解物中糖肽的信息Table 2 Information of glycosylated peptides in IgG digestion after TCNBA enrichment

The structure information is from the literature[29]. #: glycosylation sites; √: observed signals. NeuAc:N-acetylneuraminic acid.

圖 5 HRP∶BSA=1∶10(物質(zhì)的量比)酶解液富集(a)前、(b)后MALDI-TOF MS圖譜Fig. 5 MALDI-TOF MS spectra of tryptic digestion of HRP∶BSA=1∶10 (amount of substance ratio) (a) before and(b) after the enrichment The glycopeptide signals were all marked with m/z, and the non-glycopeptide signals were not marked with m/z.

2.2.2糖蛋白與非糖蛋白酶解物混合物的富集

為進(jìn)一步驗(yàn)證本材料選擇性富集糖肽的效果,對HRP∶BSA=1∶10(物質(zhì)的量比)的酶解物混合物進(jìn)行富集,富集方法見1.3.3節(jié)。結(jié)果如圖5所示,HRP∶BSA=1∶10(物質(zhì)的量比)的酶解物混合物在富集前只檢測到3個糖肽(m/z1 021、3 354、3 672,見圖5a),并且含有大量高信號強(qiáng)度的非糖肽雜質(zhì)峰;而經(jīng)材料富集后,不僅去除了大部分非糖肽雜質(zhì)的干擾,還檢測到了5個高信號強(qiáng)度的糖肽(m/z2 612、3 146、3 354、3 672、4 986,見圖5b),表明本材料對糖肽具有較強(qiáng)的選擇性和富集效果。

2.3 TCNBA用于糖蛋白的富集

2.3.1糖蛋白富集選擇性考察

為了考察TCNBA的糖蛋白富集選擇性,選用了HRP、IgG、RNaseB作為標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白的研究對象。3種標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白結(jié)構(gòu)各有特點(diǎn),糖型、糖鏈長度、親水性大小均有差異。其中HRP中性糖和氨基糖約占18%,主要有甘露糖、木糖和阿拉伯糖等。IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分,主要含有中性糖。RNaseB是一種帶有甘露糖糖鏈的糖蛋白。

圖 6 采用TCNBA材料進(jìn)行蛋白混合物分離富集的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig. 6 Sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of the protein mixtures using the SDS-PAGE Lane 1: marker. Lanes 2 and 3: protein∶BSA with the amount of substance ratio of 1∶1 before and after the enrichment, respectively. Lanes 4 and 5: protein∶BSA with the amount of substance ratio of 1∶10 before and after the enrichment, respectively. Lanes 6 and 7: protein∶BSA with the amount of substance ratio of 1∶20 before and after the enrichment, respectively.

將HRP、IgG、RNaseB 3種糖蛋白均與BSA分別按照1∶1、1∶10、1∶20的物質(zhì)的量比混合上樣,洗脫后將洗脫液冷凍干燥進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳分離,考馬斯亮藍(lán)染色后所得結(jié)果如圖6所示。其中2、4、6泳道分別為HRP(圖6a)、IgG(圖6b)、RNaseB(圖6c)與BSA的1∶1、1∶10、1∶20物質(zhì)的量比混合物富集前的條帶,3、5、7泳道分別為富集后對應(yīng)的條帶,富集后與富集前相比,不僅去除了非糖蛋白BSA,而且基本完全保留了糖蛋白HRP(圖6a)、IgG(圖6b)、RNaseB(圖6c)。結(jié)果表明,TCNBA用于富集糖蛋白具有較高的選擇性。

2.3.2多種糖蛋白與非糖蛋白混合物的富集

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TCNBA同時富集多種糖蛋白的選擇性,將該材料應(yīng)用于多種糖蛋白與非糖蛋白混合物的富集。即將HRP、IgG、RNaseB和BSA4種蛋白按照等物質(zhì)的量比混合上樣,將洗脫液冷凍干燥后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離,考馬斯亮藍(lán)染色處理。結(jié)果如圖7所示,富集后與富集前相比較,去除了非糖蛋白BSA的干擾,并且3種糖蛋白均得到保留,進(jìn)一步表明了本材料用于富集糖蛋白具有較好的選擇性和富集效果。

圖 7 采用TCNBA材料對蛋白質(zhì)混合物分離富集前后的SDS-PAGE圖Fig. 7 SDS-PAGE analysis of the protein mixture before and after the enrichment using the TCNBA material Lane 1: marker; lane 2: HRP∶IgG∶RNaseB∶BSA=1∶1∶1∶1 (amount ratio of substance); lane 3: HRP∶IgG∶RNaseB∶BSA=1∶1∶1∶1 (amount ratio of substance) after the enrichment.

圖 8 采用TCNBA材料富集人血清的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig. 8 SDS-PAGE analysis of human serum before and after enrichment using the TCNBA material Lane 1: marker; lane 2: before the enrichment; lane 3: after the enrichment. Trf: transferrin; HSA: human serum albumin.

2.3.3實(shí)際樣品中糖蛋白的富集

在人血清的實(shí)際樣品中,主要含有轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)、血清白蛋白(HSA)、IgG等,其中Trf和IgG為糖蛋白,HSA為非糖蛋白。將TCNBA用于對正常人血清中糖蛋白的富集將有助于理解方法的實(shí)際應(yīng)用價值。富集前后的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果見圖8。血清樣品在富集前所含蛋白質(zhì)大部分為HSA,含量明顯高于Trf和IgG;經(jīng)富集后的血清,不僅去除了一些雜質(zhì)蛋白質(zhì)的條帶,非糖蛋白HSA得到較明顯的去除,糖蛋白Trf和IgG得到了很大程度的保留。與已報道的文獻(xiàn)[28]相比,顯著提高了非糖蛋白HSA的去除效果,表明本材料用于人血清中糖蛋白富集具有高效性和選擇性。

3 結(jié)論

本文設(shè)計并制備了一種基于疊氮基-氰基點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的TCNBA,并將其應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)際樣品糖蛋白和糖肽的選擇性富集中。結(jié)果表明,無論是對標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白及其酶解產(chǎn)物中的糖肽,還是人血清樣品中的糖蛋白,TCNBA均展現(xiàn)出良好的富集特異性。