基于氮化碳復(fù)合材料磁性固相萃取結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定尿液中3種羥基多環(huán)芳烴

念琪循, 劉園滿, 孫 冰, 王曼曼

(華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 河北 唐山 063210)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類(lèi)由木材、煤炭和煙草等有機(jī)物不完全燃燒產(chǎn)生的持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs)。研究表明,長(zhǎng)期暴露在PAHs下可增加人體罹患肺癌、膀胱癌和乳腺癌等癌癥的發(fā)病率[1]。PAHs廣泛分布在大氣、土壤、水體和食品等介質(zhì)中,僅靠外暴露劑量不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)PAHs對(duì)健康的影響。羥基多環(huán)芳烴(hydroxylated PAHs, OH-PAHs)是PAHs經(jīng)人體代謝后主要由尿液排出的一類(lèi)生物標(biāo)志物,常作為PAHs的內(nèi)暴露指標(biāo)用于全面評(píng)價(jià)PAHs的暴露水平[2]。

分析尿液中OH-PAHs時(shí),由于尿液樣品組分復(fù)雜,且OH-PAHs在尿液中含量較低,因此需要首先對(duì)尿液樣品進(jìn)行前處理以達(dá)到凈化和富集的目的。目前,尿液中OH-PAHs的前處理通常采用液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)和固相萃取法(solid-phase extraction, SPE)[2-5]。

磁性固相萃取(magnetic solid-phase extraction, MSPE)是一種以磁性或可磁化的材料作為吸附劑、僅依靠施加外部磁場(chǎng)將目標(biāo)分析物與樣品基質(zhì)分離的前處理技術(shù)。相較常規(guī)的液液萃取法和固相萃取法,吸附劑比表面積大,擴(kuò)散距離短,只需要使用少量的吸附劑和較短的平衡時(shí)間就能實(shí)現(xiàn)低濃度目標(biāo)物的有效萃取,已成功應(yīng)用于環(huán)境、食品和醫(yī)藥分析等領(lǐng)域[6-8]。MSPE吸附劑由磁源(通常為Fe3O4)和非磁功能性材料兩部分組成,前者提供與外部磁場(chǎng)相互作用的磁性功能,后者為吸附目標(biāo)分析物提供作用位點(diǎn)。目前,基于石墨烯、碳納米管、金屬有機(jī)骨架等功能性材料作為MSPE吸附劑的工作已有報(bào)道[9,10],新型MSPE吸附劑材料的開(kāi)發(fā)仍是研究的熱點(diǎn)。

氮化碳(carbon nitride, g-C3N4)材料是一種僅由C和N兩種元素組成,具有二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的新型納米材料。該材料化學(xué)和熱穩(wěn)定性良好、比表面積大,另外,其結(jié)構(gòu)中富N功能基團(tuán)及電子離域特性使得它能夠和一些離子或分子產(chǎn)生絡(luò)合、疏水、π-π鍵、氫鍵、靜電力等相互作用,因此有望成為一種理想的吸附分離材料[11]。目前,已有文獻(xiàn)[12]報(bào)道將g-C3N4材料與Fe3O4通過(guò)物理研磨的方式制備得到磁性g-C3N4材料,但通常物理研磨獲得的復(fù)合材料穩(wěn)定性欠佳,實(shí)際應(yīng)用有一定的局限性。本研究利用溶劑熱法構(gòu)筑了磁性g-C3N4材料,并結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè),建立了一種簡(jiǎn)單、快速、高效的人尿液中3種OH-PAHs的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD,美國(guó)Agilent公司); FEI JEM-2800F聚焦離子束/場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM,美國(guó)FEI公司); Brucker D8 VENTURE單晶X射線衍射儀(XRD,德國(guó)布魯克公司); LDJ 9 600-1振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM,美國(guó)LDJ公司); Micromeritics ASAP 2460全自動(dòng)快速比表面積及孔隙分析儀(美國(guó)麥克公司)。

所用試劑除特別說(shuō)明外均為分析純。尿素和乙二醇(EG)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;六水合三氯化鐵(FeCl356H2O)、三水合乙酸鈉(NaOAc53H2O)、乙酸和無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;β-葡萄糖醛酸酶(≥105unites/mL)購(gòu)自上海市安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司;甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、乙酸乙酯和丙酮為色譜純,均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司(美國(guó))。超純水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1-羥基菲(1-OHPhe,純度98.0%)、3-羥基菲(3-OHPhe,純度98.0%)和1-羥基芘(1-OHPyr,純度98.0%)購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司,使用MeOH配制以上待測(cè)物的儲(chǔ)備液,質(zhì)量濃度為500 mg/L,于4 ℃下避光保存。將儲(chǔ)備液用MeOH稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 磁性g-C3N4的制備

參照Dong等[13]的方法制備g-C3N4材料,將10 g尿素置于箱式電阻爐中,以15 ℃/min的速率從25 ℃升溫至550 ℃,維持4 h,待電阻爐冷卻至室溫后,得到g-C3N4材料。

將270 mg g-C3N4材料經(jīng)超聲均勻分散在一定體積的EG中,加入270 mg FeCl356H2O和700 mg NaOAc53H2O,劇烈攪拌30 min,將所得混合液轉(zhuǎn)移至事先預(yù)熱的反應(yīng)釜中,于200 ℃下反應(yīng)12 h,收集反應(yīng)產(chǎn)物,使用超純水和無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌,真空干燥,得到磁性g-C3N4材料(見(jiàn)圖1a)。

圖 1 (a)磁性氮化碳(g-C3N4)材料的制備和(b)磁性固相萃取流程圖Fig. 1 Flow chart for (a) the preparation of the magnetic carbon nitride (g-C3N4) composites and (b) the magnetic solid-phase extraction

1.3 尿液樣品的制備

采集吸煙志愿者的晨尿,于-20 ℃下冷凍保存。使用時(shí)將尿液樣品于室溫下自然解凍并充分混勻,取5.0 mL于離心管中,加入10 μLβ-葡萄糖醛酸酶和5.0 mL 0.5 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5),于37 ℃避光水解過(guò)夜。將水解后的尿樣于1 500 r/min離心10 min,取上清液于4 ℃儲(chǔ)存待用。

1.4 磁性固相萃取流程

準(zhǔn)確稱(chēng)取4 mg磁性g-C3N4材料,加入2 mL酶解后的尿液樣品中,萃取3 min后,利用磁鐵將吸附劑與尿液樣品分離,棄去上清液。采用0.5 mL丙酮對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行洗脫,充分振蕩3 min后,利用磁鐵提取洗脫液,重復(fù)兩次后合并洗脫液,氮吹至干,使用甲醇定容至0.1 mL,待測(cè)(見(jiàn)圖1b)。

1.5 色譜分離條件

利用Agilent PAH柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國(guó)Agilent公司)對(duì)3種OH-PAHs進(jìn)行分離,流動(dòng)相為ACN和水的混合液。梯度洗脫程序?yàn)?0～8 min, 55%ACN; 8～10 min, 55% ACN～65%ACN; 10～16 min, 65%ACN。流速為1 mL/min,進(jìn)樣體積為20 μL。3種OH-PAHs的激發(fā)(Ex)/發(fā)射(Em)波長(zhǎng)分別為:284/383 nm(1-OHPhe)、250/360 nm(3-OHPhe)、242/396 nm(1-OHPyr)。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性g-C3N4的表征

通過(guò)SEM對(duì)復(fù)合材料的表觀形貌進(jìn)行表征,如圖2a所示,Fe3O4均勻包覆在g-C3N4材料表面;利用XRD對(duì)材料的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,由圖2b可知,復(fù)合材料同時(shí)具有Fe3O4的衍射峰和g-C3N4材料的特征衍射峰,由以上結(jié)果可知,Fe3O4與g-C3N4材料復(fù)合成功。經(jīng)磁強(qiáng)度(見(jiàn)圖2c)和比表面積分析后可知,磁性g-C3N4材料的磁化飽和度值為36.4 emu/g,比表面積達(dá)到113.7 m2/g,滿足磁性固相萃取的需求。

圖 2 磁性g-C3N4材料的(a)掃描電子顯微鏡圖(放大倍數(shù)20000)、(b)X射線衍射圖和(c)磁滯曲線圖Fig. 2 (a) SEM image (magnification of 20000), (b) X-ray diffraction (XRD) patterns and (c) magnetization curve obtained for the magnetic g-C3N4 composites

2.2 磁性固相萃取條件的優(yōu)化

吸附和洗脫條件是決定磁性固相萃取方法準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素。本研究考察了吸附劑用量、吸附時(shí)間、洗脫溶劑的種類(lèi)和體積(單次洗脫體積×洗脫次數(shù))對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響。使用2 mL 濃度均為40 μg/L的3種OH-PAHs水溶液進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn),所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

在固定吸附時(shí)間為3 min的條件下,考察吸附劑用量為0.5～5 mg時(shí),對(duì)3種目標(biāo)物吸附效率的影響。如圖3a所示,當(dāng)吸附劑用量為0.5～2 mg時(shí),1-OHPyr的吸附效率達(dá)到最大,1-OHPhe和3-OHPhe的吸附效率逐漸增加;當(dāng)繼續(xù)增加吸附劑用量至4 mg時(shí),1-OHPyr的吸附效率無(wú)顯著變化,1-OHPhe和3-OHPhe的吸附效率均達(dá)到最大值。繼續(xù)增加吸附劑用量至5 mg, 3種OH-PAHs的吸附效率均不再變化,故選用4 mg為最優(yōu)吸附劑用量。

圖 3 (a)吸附劑用量、(b)吸附時(shí)間、(c)洗脫溶劑和 (d)洗脫體積(單次洗脫體積×洗脫次數(shù))對(duì)3種OH-PAHs萃取效率的影響(n=3) Fig. 3 Effects of the (a) amount of sorbent, (b) extraction time, (c) eluting solvent, and (d) eluting volume (single eluting volume×eluting times) on the extraction efficiencies of the three OH-PAHs (n=3)

固定吸附劑用量為4 mg,考察吸附時(shí)間為1～4 min對(duì)目標(biāo)物吸附效率的影響。如圖3b所示,當(dāng)吸附時(shí)間為1 min時(shí),1-OHPyr即達(dá)到吸附平衡,1-OHPhe和3-OHPhe的吸附效率仍在增加;繼續(xù)增加吸附時(shí)間到3 min, 1-OHPyr吸附效率無(wú)明顯變化,1-OHPhe和3-OHPhe均達(dá)到吸附平衡。繼續(xù)增加吸附時(shí)間至4 min后,3種OH-PAHs的吸附效率均無(wú)顯著變化,故選用3 min作為吸附時(shí)間,同時(shí)說(shuō)明本方法可以快速吸附樣品中的3種OH-PAHs。

在最優(yōu)的上樣條件下,考察MeOH、ACN、丙酮和乙酸乙酯作為洗脫溶劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。如圖3c所示,洗脫溶劑為丙酮時(shí)3種目標(biāo)物的回收率最佳。同時(shí)考察了洗脫溶劑的體積(單次洗脫體積×洗脫次數(shù))對(duì)目標(biāo)物回收率的影響,如圖3d所示,洗脫體積從0.5 mL×1次增加至0.5 mL×2次時(shí),3種目標(biāo)物的回收率增加,當(dāng)繼續(xù)增加洗脫體積至0.5 mL×3次和0.5 mL×4次時(shí),目標(biāo)物的回收率下降,這是由于洗脫溶劑體積過(guò)大時(shí),氮吹時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致目標(biāo)物損失,因此選用0.5 mL×2次的丙酮作為最佳洗脫條件。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

采用質(zhì)量濃度為0.25～250 μg/L的OH-PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表1所示,本方法在0.25～250 μg/L范圍內(nèi)對(duì)3種OH-PAHs均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均為0.999。以信噪比為S/N=3和S/N=10計(jì)算方法的檢出限(LODs)和定量限(LOQs),分別為0.08和0.25 μg/L。結(jié)果表明本方法具有良好的靈敏度。

表 1 本方法的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear ranges, linear equations, correlationcoefficients (r), LODs and LOQs of this method

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.3.2回收率和精密度

對(duì)同一尿液樣品,將1-OHPhe、3-OHPhe和1-OHPyr標(biāo)準(zhǔn)品分別添加至0.5 、1.25 和2.5 μg/L 3個(gè)水平 ,經(jīng)本方法前處理后,計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率,以日內(nèi)和日間分別重復(fù)3次測(cè)定得到的色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)計(jì)算精密度,結(jié)果如表2所示,方法對(duì)3種OH-PAHs的回收率為90.1%～102%,日內(nèi)精密度為1.5%～7.7%,日間精密度為2.2%～8.7%,表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

表 2 本方法的回收率和精密度(n=3)Table 2 Recoveries and precisions of this method (n=3)

圖 4 加標(biāo)3種OH-PAHs(均為2.5 μg/L)的尿液樣品 酶解后(a)直接進(jìn)樣、(b)經(jīng)本方法前處理后進(jìn)樣及(c)OH-PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 Fig. 4 Chromatograms of the enzymatic hydrolyzed urine sample (spiked with 2.5 μg/L of each OH-PAH) (a) with direct analysis, (b) pretreated by this method before the analysis, and (c) the standard solution of OH-PAHs

2.3.3凈化和富集效果

在最優(yōu)條件下,結(jié)合HPLC-FLD分析,將加標(biāo)3種OH-PAHs(質(zhì)量濃度均為2.5 μg/L)的尿液樣品酶解,經(jīng)本方法富集凈化前后分別進(jìn)樣分析。圖4a為直接將尿液樣品進(jìn)行分析的結(jié)果,雜質(zhì)峰明顯,3種OH-PAHs均有檢出,但樣品峰響應(yīng)較低;而經(jīng)過(guò)本法固相萃取后,如圖4b所示,雜質(zhì)峰明顯降低,在對(duì)應(yīng)OH-PAHs出峰位置(見(jiàn)圖4c)均檢出樣品峰且響應(yīng)高于直接進(jìn)樣的結(jié)果,說(shuō)明該方法能夠有效去除尿液中的雜質(zhì),富集OH-PAHs,當(dāng)酶解后的尿液上樣體積為2 mL時(shí),對(duì)OH-PAHs的富集倍數(shù)為10。

2.4 實(shí)際樣品分析

利用本方法對(duì)4名吸煙志愿者的尿液樣品進(jìn)行分析。如表3所示,有2例樣品中檢出1-OHPhe,質(zhì)量濃度分別為(1.65±0.04)和(1.75±0.02) μg/L;有3例樣品檢出3-OHPhe,質(zhì)量濃度為(1.89±0.05)～(2.26±0.10) μg/L;全部樣品均檢出1-OHPyr,質(zhì)量濃度為(4.24±0.02)～(4.46±0.01) μg/L。為了進(jìn)一步說(shuō)明本方法的可行性,對(duì)4例實(shí)際尿液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)濃度為2.5 μg/L,對(duì)尿液中的OH-PAHs的回收率為90.7%～108%, RSD≤8.2%,方法準(zhǔn)確度和精密度令人滿意。

表 3 吸煙志愿者尿液中的OH-PAHs分析結(jié)果(n=3)Table 3 Analytical results of OH-PAHs in the urine samples of smoking volunteers (n=3)

2.5 與文獻(xiàn)方法對(duì)比

將本方法同文獻(xiàn)[3-5,14]方法進(jìn)行對(duì)比(見(jiàn)表4),本方法靈敏度與文獻(xiàn)方法相當(dāng),且方法準(zhǔn)確可靠,吸附劑用量?jī)H需要4 mg, 3 min即可完成吸附,說(shuō)明本方法簡(jiǎn)單、快速、高效,可用于人尿液中OH-PAHs的常規(guī)分析。

表 4 本方法與文獻(xiàn)方法對(duì)尿液中OH-PAHs分析結(jié)果的對(duì)比Table 4 Comparison of the analysis results of this method with methods in literatures for the determination of OH-PAHs in urine

DLLME: dispersive liquid-liquid microextraction; MSPE: magnetic solid-phase extraction.

3 結(jié)論

本研究首次以溶劑熱法制備磁性g-C3N4材料,將其用于尿液中3種OH-PAHs的前處理中,并結(jié)合HPLC-FLD對(duì)吸煙志愿者的尿液樣品進(jìn)行分析。本方法能夠簡(jiǎn)單、快速、高效的富集和凈化尿液中的3種OH-PAHs,展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。