廣西不孕不育人群α-地中海貧血基因分型與篩查結(jié)果分析

唐蘭艷 呂福通 柳青 陳一君 謝丹尼

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生計(jì)生委生殖中心（南寧530021）

α-地中海貧血（alpha-thalassemia，α-地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，以小細(xì)胞低色素性貧血為主要特征，其發(fā)生機(jī)制主要是由于α-珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致其合成的量部分減少或完全缺失。α+地貧為僅一條染色體上的一個(gè)α 基因發(fā)生缺失或突變，α 鏈合成部分受到抑制；α0地貧為一條染色體上的兩個(gè)α 基因均發(fā)生缺失，完全無α 鏈合成，故臨床上α-地貧患者的嚴(yán)重程度與α 基因缺陷的數(shù)量有關(guān)［1］，其中血紅蛋白H ?。╤emoglobin H disease，HbH ?。┡c血紅蛋白Bart's 胎兒水腫綜合征（hemoglobin Bart's hydrops fetalis syndrome，Hb Bart's）對α-地貧患者的危害最大。α-地貧作為全球最常見的單基因遺傳病，在地中海地區(qū)、中東、北非以及東南亞國家等多見，而在我國主要分布于廣西和廣東等地［2］。為了提高廣西不孕不育人群進(jìn)行體外受精-胚胎移植（In-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）前以及孕期保健質(zhì)量，開展α-地貧篩查、基因診斷、產(chǎn)前診斷以及遺傳咨詢等可有效預(yù)防或減少α-地貧患兒出生。本文對到我中心就診的10 020 例不孕不育者進(jìn)行血液學(xué)參數(shù)、血紅蛋白電泳以及基因檢測，研究分析該人群α-地貧攜帶率、基因分型與基因頻率分布等情況，可為廣西不孕不育人群α-地貧患者進(jìn)行IVF-ET 提供依據(jù)或數(shù)據(jù)支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年1月1日至2018年1月31日到我中心就診并進(jìn)行地中海貧血篩查和基因檢測的不孕不育者10 020 例，其中男2 799例，年齡（35.9 ± 6.3）歲；女7 221 例，年齡（34.0 ±5.0）歲。就診的不孕不育人群絕大多數(shù)來自廣西各市縣及鎮(zhèn)，少數(shù)來自省外。

1.2 方法

1.2.1 研究策略 所有研究人群空腹8 h 以上并于次日早晨采集外周靜脈血進(jìn)行血細(xì)胞學(xué)分析，根據(jù)《廣西婚前保健和孕期保健地中海貧血篩查與診斷技術(shù)規(guī)范（試行）》通知要求，篩查陽性標(biāo)準(zhǔn)為紅細(xì)胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）＜82 fl 和（或）紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）＜27 pg。篩查陽性者再結(jié)合血紅蛋白電泳結(jié)果，對血紅蛋白A2（hemoglobinA2，HbA2）＜2.8%者以及臨床醫(yī)師懷疑為α-地貧而上述篩查實(shí)驗(yàn)陰性的部分人群進(jìn)行α-地貧基因診斷。另外HbA2＞3.5%和（或）胎兒血紅蛋白（hemoglobin F，HbF）＞2%者初診為β-地貧，另行β-地貧基因診斷，不納入本研究中。

1.2.2 血液學(xué)檢測 使用Sysmex-XS-800i 全自動(dòng)血液分析儀（希森美康公司，日本）測定MCV、MCH、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）等紅細(xì)胞參數(shù)；采用Sebiacapillarys 2（Sebia 公司，法國）檢測HbA2和HbF。所有項(xiàng)目均在室內(nèi)質(zhì)控在控的條件下進(jìn)行樣本檢測。

1.2.3 基因檢測 采用核酸提取試劑（離心柱型）進(jìn)行基因組DNA 提取，試劑由亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司提供；使用Gap-PCR 技術(shù)測定缺失型α-地貧，試劑購自深圳益生堂生物企業(yè)有限公司；采用PCR-反向點(diǎn)雜交法測定非缺失型α-地貧，試劑購自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料以（x ± s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-地貧基因分型及基因型頻率 在10 020 例不孕不育受檢者中，通過基因診斷共檢出α-地貧患者624 例，檢出率為6.23%；共檢出19 種基因型，其中以輕型--SEA∕αα 為最常見，其次為靜止型-α3.7∕αα 和αCSα∕αα。結(jié)果還顯示，在基因型分別為--SEA∕αα、-α3.7∕αα 和αCSα∕αα 的患者中，男性與女性的構(gòu)成比差別不大。見表1。

2.2 3種α-地中海貧血表型血液學(xué)參數(shù)及血紅蛋白電泳結(jié)果 靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者M(jìn)CV 均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者M(jìn)CV 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧男、女患者M(jìn)CV 與中間型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者M(jìn)CH 均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者M(jìn)CH 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧女患者M(jìn)CH 高于中間型女患者（P＜0.05），輕型α-地貧男患者M(jìn)CH 與中間型男患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者M(jìn)CHC 均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者M(jìn)CHC 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧男、女患者M(jìn)CHC 與中間型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者Hb 均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者Hb 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧女患者Hb 高于中間型女患者（P＜0.05），輕型α-地貧男患者Hb 與中間型男患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者RBC 均高于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者RBC 低于輕型男、女患者（均P＜0.05），靜止型α-地貧女患者RBC 低于中間型女患者（P＜0.05），靜止型α-地貧男患者RBC 與中間型男患者以及輕型α-地貧男、女患者RBC 與中間型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者紅細(xì)胞壓積（hematocrit，HCT）均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者HCT 均高于輕型及中間型（均P＜0.05），輕型α-地貧女患者HCT 高于中間型女患者（P＜0.05），輕型α-地貧男患者HCT 與中間型男患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者HbA2均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），靜止型和輕型α-地貧男、女患者HbA2均高于中間型（均P＜0.05），靜止型α-地貧男、女患者HbA2與輕型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者HbF 之間以及他們與非地貧男性、女性比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表1 不孕不育人群α-地中海貧血基因分型及分布Tab.1 The distribution of genotypes and genotyping for infertile subjects with alpha-thalassemia

3 討論

α-地貧從表型上可分為靜止型、輕型、中間型或HbH 病和重型或Hb Bart’s 胎兒水腫綜合征，各型的臨床表現(xiàn)存在較大不同，比如α-地貧患者的Hb 濃度可從正常至嚴(yán)重貧血（Hb 75 ～155 g∕L），MCV ＜79 fl，MCH ＜27 pg，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)可正?；蛟龈撸≧BC 6 ～7 × 1012∕L），HbA2%結(jié)果正常或輕度降低（正常人參考范圍2.0% ～3.3%）［3］，這取決于非功能性α 基因的數(shù)量，可因α 和β 鏈、β-地貧和多個(gè)α 基因引起的血紅蛋白變異體之間相互作用的多樣性而導(dǎo)致α-地貧個(gè)體結(jié)果的差異性。本研究通過比較不孕不育人群α-地貧三種表型血液學(xué)參數(shù)及血紅蛋白電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜止型α-地貧男、女患者M(jìn)CV 和MCH 分別為男MCV：（78.40 ± 3.95）fl，女MCV：（78.83 ± 5.55）fl；男MCH：（25.96 ±1.47）pg，女MCH：（25.69 ± 2.18）pg，與上述結(jié)果［3］相似，且輕型及中間型α-地貧患者M(jìn)CV、MCH 比靜止型更低。另外，靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者M(jìn)CV、MCH、MCHC、Hb、HCT 和HbA2均低于非地貧男性、女性（均P＜0.05），且MCV、MCH、MCHC、Hb 和HCT 都存在以下規(guī)律：靜止型＞輕型＞中間型，說明α 基因突變或缺失的數(shù)量越多，α-地貧患者血液學(xué)指標(biāo)結(jié)果異常的程度越大；而RBC 均高于非地貧男性、女性（均P＜0.05），在靜止型、輕型及中間型α-地貧男、女患者中有逐漸升高的趨勢，說明α-地貧患者RBC 增高的機(jī)制可能是由于存在慢性MCH 降低而出現(xiàn)的代償現(xiàn)象，這與VELASCO-RODRIGUEZ 等［4］研究結(jié)果相似。在實(shí)驗(yàn)室檢查中，MCV ＜80 fl 通常用于地貧的初步篩查，盡管該截?cái)嘀祹缀跄芎Y查出所有α0地貧攜帶者，但約有75%的α+地貧攜帶者不能被檢出［5］。另外大多數(shù)輕型地貧攜帶者的血液學(xué)指標(biāo)和血紅蛋白電泳結(jié)果通常表現(xiàn)正常，此時(shí)α-地貧的漏檢率極高，因此為了進(jìn)一步明確診斷α-地貧，以便更全面了解該病的臨床表型，有必要對α 基因進(jìn)行分子診斷。

表2 3 種α-地中海貧血表型血液學(xué)參數(shù)及血紅蛋白電泳結(jié)果Tab.2 The results of hemoglobin electrophoresis and hematologic parameters in three phenotypes of alpha-thalassemia.Data present mean ± SD（standard deviation） ±s

表2 3 種α-地中海貧血表型血液學(xué)參數(shù)及血紅蛋白電泳結(jié)果Tab.2 The results of hemoglobin electrophoresis and hematologic parameters in three phenotypes of alpha-thalassemia.Data present mean ± SD（standard deviation） ±s

項(xiàng)目MCV（fl）MCH（pg）MCHC（g∕L）Hb（g∕L）RBC（х1012∕L）HCT HbA2（%）HbF（%）靜止型男性78.40±3.95 25.96±1.47 331.19±8.27 149.52±9.94 5.77±0.41 45.14±2.67 2.42±0.36 0.64±0.45女性78.83±5.55 25.69±2.18 325.56±8.98 126.94±11.11 4.95±0.37 38.96±2.93 2.19±0.53 0.62±0.42輕型男性65.65±4.05 21.32±1.31 324.81±8.00 139.08±8.08 6.55±0.51 42.82±2.32 2.34±0.33 0.71±0.53女性64.70±4.13 20.85±1.45 322.22±7.20 118.58±8.21 5.70±0.41 36.79±2.25 2.36±0.22 0.69±0.47中間型男性60.43±11.59 18.21±3.39 303.43±24.26 119.71±22.72 6.61±0.93 39.39±5.96 1.41±0.57 0.66±0.26女性61.42±9.95 19.28±2.91 314.75±15.80 104.44±17.52 5.45±0.75 33.09±4.80 1.47±0.69 0.66±0.26非地貧人群男性87.37±4.10 29.62±1.52 339.11±8.60 155.23±9.69 5.25±0.38 45.77±2.56 2.67±0.24 0.51±0.30女性86.87±3.67 28.91±1.41 332.81±7.74 132.87±8.41 4.60±0.34 39.92±2.29 2.58±0.29 0.59±0.33

HbH ?。ㄖ虚g型α-地貧）是一種嚴(yán)重而非致命的α-地貧類型，臨床特征為明顯的小細(xì)胞低色素溶血性貧血，可能機(jī)制是3 個(gè)α 基因缺失或缺陷，只能合成少量的α 鏈，引起β 鏈相對增多，形成HbH（β 四聚體，β4），而HbH 是一種不穩(wěn)定血紅蛋白，易被氧化使β4 解離成游離的單鏈，沉積在紅細(xì)胞內(nèi)后形成包涵體，造成紅細(xì)胞膜僵硬易受損而被脾臟破壞吞噬。HbH 病患者通常表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性慢性溶血性貧血，但在氧化型藥物、感染、脾腫大或輕度黃疸等因素刺激下可導(dǎo)致急性溶血發(fā)作［6］。一般來說，臨床上α-地貧患者的嚴(yán)重程度與α 鏈缺陷的程度存在很大關(guān)聯(lián)，非缺失型α+地貧可能比缺失型α+地貧合成更少的α 鏈，所以這可能是非缺失型α+與α0復(fù)合雜合子的HbH病患者通常比缺失型α+與α0復(fù)合雜合子HbH 病患者更嚴(yán)重的原因［7］。本研究不孕不育人群中HbH 病的檢出率為0.229%（23∕10 020），低于HE等［8］報(bào)道廣西百色市HbH 病的檢出率（0.928%），造成兩者差異較大的原因可能是該研究所選取對象的年齡范圍較大（1～45 歲），空間跨度較??；而本研究之對象絕大多數(shù)來自廣西各市縣及鎮(zhèn)，還有少數(shù)來自外省，空間跨度大，年齡段集中且僅限定為人群中的一小部分（不孕不育者）。但HbH 病的基因型都是以--SEA∕-α3.7為主。

Hb Bart's 胎兒水腫綜合征（重型α-地貧）屬于α-地貧最嚴(yán)重的類型，是α0地貧的純合子狀態(tài)，4個(gè)α 基因缺失致使完全無α 鏈合成，胎兒期即可發(fā)生大量γ 鏈聚合形成四聚體γ4（Hb Bart's），該物質(zhì)對O2具有很高的親合力，極易造成胎兒嚴(yán)重缺氧，因此胎兒在妊娠晚期可于宮內(nèi)窒息或出生后不久死亡。當(dāng)夫妻雙方都是α0地貧攜帶者時(shí)，他們將有25%的機(jī)會懷上Hb Bart's 胎兒水腫綜合征的后代，而且此類妊娠女性屬于高風(fēng)險(xiǎn)人群，將面臨出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥［1］，比如由于胎盤過大或心理負(fù)擔(dān)過重造成先兆子癇、難產(chǎn)和產(chǎn)后大出血等。一項(xiàng)回顧性研究［1］顯示，廣西壯族自治區(qū)Hb Bart's 胎兒水腫綜合征病例的α-地貧基因型絕大多數(shù)基因型為--SEA∕--SEA，極少數(shù)為--SEA∕--THAI，病例數(shù)呈逐年上升趨勢，可能原因有：由于人口健康宣傳教育，群眾追求健康質(zhì)量的意識觀念已明顯增強(qiáng)；專門針對地貧進(jìn)行系統(tǒng)培訓(xùn)學(xué)習(xí)的專業(yè)醫(yī)學(xué)人才不斷增加；地貧篩查已包括在婚前及產(chǎn)前體檢中；當(dāng)?shù)卣褳閺V西當(dāng)?shù)鼐用襁M(jìn)行地貧和產(chǎn)前診斷成立了專項(xiàng)基金等。本研究結(jié)果顯示不孕不育人群共檢出α-地貧基因型19 種，總攜帶率為6.23%（624∕10 020），而馬升俊等［9］在廣西南寧地區(qū)研究中共檢出了15 種α-地貧基因型，總攜帶率略高（8.54%）。本研究除了基因型αWSα∕αα 在女性中占較大比例外，其余基因型在男性與女性之間所占比例相差不大，α0地貧個(gè)體占3.02%（303∕10020），其中最常見的基因型為--SEA∕αα，與外省報(bào)道的結(jié)果相似［10-13］。

由于飲食方式、生活方式、心理壓力以及外界環(huán)境等因素的綜合影響，廣西不孕不育患者成為了一個(gè)特殊的群體，近年來該群體的數(shù)量呈日漸增長趨勢，加之α-地貧在廣西地區(qū)具有很高的患病率，α0地貧攜帶率也較高，若與α+或α0攜帶者結(jié)合有產(chǎn)下HbH 病或Hb Bart's 胎兒水腫綜合征后代的風(fēng)險(xiǎn)，將給政府、家庭以及小孩造成嚴(yán)重的健康與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此本研究為提高廣西不孕不育人群α-地貧患者進(jìn)行IVF-ET 前和孕期保健質(zhì)量提供了一些依據(jù)或數(shù)據(jù)支持，通過篩查、基因診斷、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等多種手段綜合應(yīng)用可科學(xué)有效預(yù)防及避免α-地貧患兒（尤其是Hb Bart's 患兒）的出生，從而達(dá)到科學(xué)指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。