超聲微泡靶向基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1下調(diào)的腺病毒治療大鼠肝纖維化效果

張燕 范曉翔 章美武 莊魯輝 毛達峰

寧波市第二醫(yī)院介入治療科（浙江寧波315010）

肝纖維化是肝硬化的基礎，可由多種原因引起，病情呈動態(tài)進展，最終進入肝纖維化的不可逆期，即肝硬化階段［1-2］。目前針對性治療肝纖維化的方案甚少，僅少數(shù)藥物處于臨床試驗階段，其有效性尚不清楚［3］。國內(nèi)外最新研究提示基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）-基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）系統(tǒng)能調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的降解，且TIMP-1 的強表達會促進肝纖維化的進展［4］。此外，張燕等［5］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染反義TIMP-1 質(zhì)粒載體可以顯著降低大鼠肝纖維化模型中TIMP-l 及MMP-13 蛋白的表達，改善肝纖維化程度。以上提示肝纖維化的基因治療方向可從抑制TIMP-1 入手，而如何有效導入下調(diào)TIMP-1基因表達的載體則令人困擾。腺病毒轉(zhuǎn)染雖有較高效率，但其靶向性差、免疫原性偏大等缺陷使其開發(fā)應用停滯不前，改善腺病毒載體并降低機體免疫反應已成為臨床工作亟需攻克的難點［6］。超聲介導靶向微泡造影是國內(nèi)較新的研究方向，多篇研究報道［7］顯示其能安全有效地增加病毒轉(zhuǎn)染，是一種重要的基因和藥物載體，但其介導下調(diào)TIMP-1 基因表達載體影響肝纖維化的研究甚少報道。因此，本研究欲建立下調(diào)TIMP-1 基因的重組腺病毒（Ad-shTIMP-1），探究超聲微泡的轉(zhuǎn)染效率，分析基因治療的價值，為肝纖維化的治療提供有力證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物及分組 清潔級SD 大鼠由寧波市第二院實驗動物中心提供，雌雄各半，平均體質(zhì)量（200±20）g，每籠4 只，給予適宜溫度（22 ℃），相對濕度保持在55%～70%，自由飲水及進食，每天光照∕黑暗各12 h，適應性喂養(yǎng)1周后進行后續(xù)實驗。

1.1.2 試劑 CCl4AR 級（上海展云化工有限公司）、橄欖油CP 級（山東浩中化工科技有限公司）；超聲微泡造影劑SonoVue（意大利Bracco 公司）；兔抗鼠MMP-13、TIMP-1 單克隆抗體、β 肌動蛋白（action）一抗及辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗IgG（美國Santa Cruz 公司）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、羥脯氨酸（Hyp）檢測試劑盒（上海百祥生物科技有限公司）；透明質(zhì)酸（HA）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、層粘連蛋白（LN）定量測定試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson 染色試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司）；RIPA 細胞裂解液、BCA 定量試劑盒和ECL 化學發(fā)光液（北京賽百盛基因技術有限公司）。

1.1.3 儀器 V-5100H 型可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）、P5 彩色多普勒超聲波診斷儀（美國GE）、3K15 離心機（德國Sigma 公司）、DXC800 全自動生化分析儀（美國Beckman 有限公司）、全自動冷凍石蠟切片機（廣州兆康生物科技有限公司）、ECLIPSE Ts2R-FL 多功能倒置熒光顯微鏡（日本NIKON）、ELX800 酶標分析儀（美國Bio Tek）、Wellwash 全自動洗板機（美國Thermo 公司）。

1.2 下調(diào)TIMP-1 基因的重組腺病毒的構建、提純及滴度測定 本研究所用靶向TIMP-1 的shRNA（ 正 義 鏈 ：GCCTTCGTAAAGACCTATAGTACTATAGGTCTTTACGAAGGC；反義鏈：GCCTTCGTAAAGACCTATAGTACTATAGGTCTTTACGAAGGC）重組腺病毒Ad-shTIMP-1 在上海漢恒生物科技有限公司輔助下涉及并構建，用增強綠色熒光蛋白（EGFP）標記，其構建方法及包裝參考李匯等［8］的研究。腺病毒穿梭質(zhì)粒構建成功并經(jīng)酶切鑒定后，將重組正確的腺病毒質(zhì)粒在大腸桿菌DH5a 擴增，凝膠回收。將重組腺病毒轉(zhuǎn)染至HEK-293 細胞（融合達70%～80%）進行擴增，密切觀察細胞病變效應（出現(xiàn)噬斑），3 000 r∕min 離心5 min，收集上清液。取部分上清液再次感染293 細胞，反復凍融、離心收集上清液，如此感染多次后在293 細胞中擴增到所需滴度1 × 1010pfu∕mL，定期監(jiān)測EGFP 的表達。利用氯化銫密度梯度離心法純化，TCID50 測定病毒滴度，同時采用實時熒光定量PCR 測定重組腺病毒TIMP-1 的表達。刪選陽性表達者，-80 ℃保存于病毒保存液（Tris pH 8.0 + Mg-Cl2+蔗糖）中，用于后續(xù)實驗。

1.3 制備重組腺病毒超聲造影劑 SonoVue 為內(nèi)含六氟化硫，外包磷脂的凍干粉末，使用時需用生理鹽水溶解為白色乳狀混懸液。完全溶解后，其微泡濃度約為2 × 108個∕mL，平均直徑在2.5 μm 左右。將上述重組腺病毒用有限稀釋法調(diào)整其滴度為5×107pfu∕mL，置于24 孔板中，取1 mL SonoVue 微泡和1ml 腺病毒混合震蕩，冰上孵育2 h，使重組腺病毒與微泡表面結合。靜置分層后棄去下清液，PBS 重懸，此時重組腺病毒滴度約為2×107pfu∕mL。

1.4 建立肝纖維化模型 實驗首次以5 mL∕kg 皮下注射50%CCl4混合液（橄欖油2：3 稀釋），隨后劑量改為3 mL∕kg，每周2 次，持續(xù)8 周。對照組以等量橄欖油進行皮下注射。第8 周時，處死對照組及建模的大鼠各3 只剖取肝臟標本，HE 染色以確定肝纖維化模型成功復制。

1.5 動物分組及處理 選取建模成功的40 只大鼠隨機分為5 組，每組8 只。包括：（1）模型組；（2）腺病毒組（僅給予Ad-shTIMP-1 重組腺病毒）；（3）腺病毒微泡組（微泡造影劑+Ad-shTIMP-1 重組腺病毒）；（4）實驗組（超聲輻照+ 微泡造影劑+ AdshTIMP-1 重組腺病毒）；（5）超聲腺病毒組（超聲輻照+ Ad-shTIMP-1 重組腺病毒）。大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后，注射器抽取1 mL 造影劑∕重組腺病毒∕重組腺病毒造影劑混合液，經(jīng)尾靜脈快速推注，隨后追加1.0 mL 生理鹽水將管腔沖洗干凈。模型組以等量0.9%生理鹽水注射。注射后，實驗組及超聲腺病毒組大鼠仰臥位固定，腹部剃毛（8%硫化鈉），將超聲探頭定位于肝臟區(qū)，采用電子凸陣探頭，設置其頻率為1.6 MHz、接受頻率3.2 MHz、聲強為2 W∕cm2，聚焦深度定在3 cm，機械指數(shù)調(diào)至最大，超聲輻照5 s，間歇5 s，共30 次。實驗過程中，保持儀器設置一致。喂養(yǎng)48 h 后禁食8 h，腹主動脈取血，處死大鼠，檢測相關指標。

1.6 檢測指標

1.6.1 轉(zhuǎn)染效率檢測 大鼠處死后，取其肝臟，冰凍切片，后用冷丙酮固定，PBS 漂洗。倒置熒光顯微鏡下觀察各組EGFP 的表達情況。在波長為488 nm 的紫外光激發(fā)下，EGFP 可顯示綠色熒光。每片隨機取6 個視野，統(tǒng)計熒光陽性細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)染率。

1.6.2 組織學檢測 取各組大鼠新鮮肝左葉，投入10%福爾馬林溶液中固定24 h。經(jīng)修剪后放入包埋盒中，酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)浸蠟、包埋、切片，片厚4 μm。經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精至水后，HE、Masson 染色劑染色。觀察肝組織結構變化并由病理科醫(yī)生判斷肝纖維化分期（S）：（1）0級，無纖維化；（2）1 級，匯管區(qū)纖維化擴大，小葉中央纖維化；（3）2 級，纖維沉積擴展于匯管區(qū)周圍，存在纖維間隔；（4）3 級，小葉邊緣纖維化，小葉結構紊亂；（5）4 級，肝硬化，假小葉形成。

1.6.3 肝纖維化指標檢測 取各組大鼠腹主動脈血液，靜置30 min，3 000 r∕min 離心10 min 分離血清，賴氏法測定各組大鼠AST、ALT 含量，放射免疫法測定各組大鼠HA、CIV、LN 含量，酸水解法測定Hyp 含量。

1.6.4 Western blot 大鼠處死后，取20 mg 新鮮肝臟組織，研磨粉碎，于4 ℃下加入RIPA 緩沖液、PMSF（10 mg∕mL）勻 漿，15 000 r∕min 離 心1 min。再次加入PMSF，冰育30 min，后移入離心管中，4 ℃離心15 min（15 000 r∕min），取上清，-20 ℃保存。BCA 試劑盒測定蛋白濃度，取相同質(zhì)量的RIPA 裂解液，并加等體積的2 × 電泳上樣緩沖液。沸水浴3 min，上樣，以5%濃縮膠和12%分離膠進行電泳（每孔100 μg），再390 mA 40 min 轉(zhuǎn)膜，膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍染色。室溫下，用5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入MMP-13、TIMP-1一抗（稀釋1∶200），保持4 ℃，過夜孵育。PBS 洗3次，加入HRP 標記的二抗（稀釋1∶5 000），37 ℃下輕搖3 h。ECL 顯影，Image J 軟件分析，以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.7 統(tǒng)計學方法 SPSS 19.0 軟件分析實驗所得數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，單因素方差分析顯示各組轉(zhuǎn)染率、血清檢測指標及蛋白表達差異，兩組間比較采用SNK-q檢驗。各組大鼠肝纖維化等級比較采用非參數(shù)檢驗Kruskal-WallisH，所有計算均采用雙側(cè)檢驗。

2 結果

2.1 重組腺病毒載體微泡造影劑 光學顯微鏡下，Ad-shTIMP-1 重組腺病毒超聲微泡混合物形態(tài)類圓形，粒徑較小，表面光滑，大小較一致，分布較為均勻，單個微泡居多，分散度較好；與未攜帶腺病毒的超聲微泡相比，其形狀、大小并無明顯改變。在400 倍倒置熒光顯微鏡下可見微泡被綠色熒光包裹，見圖1。

圖1 Ad-shTIMP-1 重組腺病毒超聲微泡混合物特征Fig.1 Characteristics of ultrasound microbubble mixture of Ad-shTIMP-1 recombinant adenovirus

2.2 各組轉(zhuǎn)染效率檢測 轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光顯微鏡下觀察到腺病毒組、腺病毒微泡組、實驗組、超聲腺病毒組細胞內(nèi)存在強度不一的綠色熒光，主要集中于細胞胞漿。其中，實驗組熒光表達較強；而腺病毒組、腺病毒微泡組、超聲腺病毒組僅有少量熒光表達，強度較弱。經(jīng)計算，腺病毒組、腺病毒微泡組、實驗組、超聲腺病毒組的轉(zhuǎn)染率分別為（32.39 ± 4.07）% 、（35.68 ± 5.15）% 、（54.81 ±7.22）%、（30.90 ± 3.44）%。單因素方差分析顯示：實驗組轉(zhuǎn)染率高于腺病毒組（q= 3.418）、腺病毒微泡組（q= 3.756）、超聲腺病毒組（q= 5.502），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組肝纖維化分級比較 病理檢查可見模型組、腺病毒組大鼠肝組織內(nèi)肝小葉結構不清，炎性細胞浸潤程度較重，肝細胞有明顯增大腫脹及點狀壞死現(xiàn)象，同時匯管區(qū)擴大，膠原纖維明顯聚集，粗大增生的膠原纖維從匯管區(qū)和中央靜脈伸出分割、破壞正常肝小葉，纖維間隔形成。腺病毒微泡組及超聲腺病毒組大鼠纖維組織增生及膠原纖維沉積相對減少，氣球樣變性及脂肪變性有所緩解，但仍存在纖維化。實驗組纖維間隔變細，炎癥減輕、肝小葉結構破壞程度及肝細胞壞死程度均得以改善，纖維化程度較輕，見圖3。對比5 組大鼠肝纖維化等級，Kruskal-WallisH檢驗顯示差異有統(tǒng)計學意義（H= 15.507，P= 0.001）；兩兩比較結果顯示：實驗組肝纖維化分級優(yōu)于其余4 組，而腺病毒微泡組及超聲腺病毒組肝纖維化分級低于模型組與腺病毒組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

圖2 各組轉(zhuǎn)染效率比較（×40）Fig.2 Comparison of transfection efficiency in each group（×40）

圖3 各組大鼠肝組織學檢測結果比較（×100）Fig.3 Comparison of liver histology results of rats in each group（×100）

表1 各組大鼠肝纖維化分級比較Tab.1 Comparison of liver fibrosis grades in rats of each group只

2.4 各組大鼠血清檢測指標結果 與模型組進行比較，腺病毒組、腺病毒微泡組、超聲腺病毒組、實驗組大鼠血清ALT、AST、HA及LN活性下降，其中，以實驗組大鼠ALT、AST、HA、LN含量活性最低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腺病毒組、腺病毒微泡組、超聲腺病毒組3組間差異并無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對比各組CIV、Hyp含量差異，結果顯示：模型組與腺病毒組、腺病毒微泡組、超聲腺病毒組CIV、Hyp含量相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而實驗組CIV、Hyp活性低于上述4組（P＜0.05），見表2。

2.5 各組大鼠MMP-13、TIMP-1 蛋白表達差異目的基因與β-actin 得灰度比值結果顯示：與模型組相比，其余4 組TIMP-1 蛋白表達均升高，而MMP-13 的表達含量則降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組相對腺病毒組、腺病毒微泡組、超聲腺病毒組，其TIMP-1 蛋白表達更高，MMP-13 蛋白表達則更低（P＜0.05）；而腺病毒組、腺病毒微泡組、超聲腺病毒組3 組MMP-13、TIMP-1 比較則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4、5。

表2 各組大鼠肝纖維化生化指標差異Tab.2 Differences in biochemical markers of liver fibrosis in rats of each group ±s

表2 各組大鼠肝纖維化生化指標差異Tab.2 Differences in biochemical markers of liver fibrosis in rats of each group ±s

注：與模型組進行比較，aP ＜0.05；與腺病毒組進行比較，bP ＜0.05；與腺病毒微泡組進行比較，cP ＜0.05；與實驗組比較，dP ＜0.05

組別模型組腺病毒組腺病毒微泡組實驗組超聲腺病毒組ALT（U∕L）269.0±140.7 243.1±152.8a 230.4±65.3a 173.2±71.5abc 237.6±84.1ad AST（U∕L）305.6±104.8 254.4±72.3a 263.8±90.1a 203.5±64.4abc 259.3±85.7ad HA（μg∕L）289.4±42.5 262.0±33.4a 270.6±55.2a 175.8±34.0abc 264.0±32.9ad CIV（μg∕L）8.3±0.7 8.1±0.9 7.5±0.6 6.0±0.5abc 7.7±0.4d LN（μg∕L）112.4±15.6 95.9±18.2a 101.6±13.5a 74.7±11.8abc 96.5±12.4ad Hyp（mg∕g）15.3±0.9 13.4±0.3 12.8±0.5 9.3±0.7abc 14.5±0.6d

圖4 各組Western blot 結果分析Fig.4 Analysis of western blot results in each group

圖5 各組大鼠MMP-13、TIMP-1 蛋白表達差異Fig.5 Differential expression of MMP-13 and TIMP-1 protein in rats of each group

3 討論

研究顯示病因治療可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化［9］。以干擾素等藥物干預為主的病因治療在改善患者預后，降低遠期肝硬化、肝細胞癌發(fā)生率及提高生存率方面均有較為明顯的優(yōu)勢，但其逆轉(zhuǎn)進展性肝纖維化和改善各類組織學指標的能力并不理想［10］。隨著疾病研究的不斷深入及分子生物學的快速發(fā)展，臨床發(fā)現(xiàn)肝纖維化的發(fā)生涉及復雜的信號傳導系統(tǒng)，其最主要的病理特征是以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過度堆積。ARFFA等［11］的研究顯示肝細胞持續(xù)受損可激活肝星形細胞，后者在多種活化細胞因子的作用下，轉(zhuǎn)化為肌纖維細胞，分泌轉(zhuǎn)化生長因子，作用于肝星形細胞本身，加速其向肌纖維細胞轉(zhuǎn)化的速度。同時，肌纖維細胞可分泌MMPs∕TIMPs，打破細胞外基質(zhì)的合成∕分解平衡，造成細胞外基質(zhì)大量沉積，引起肝細胞一系列組織學變化［12］。由上述機制可知，采用基因治療從分子層面阻斷肝纖維化進展的治療方案有一定理論依據(jù)和應用前景。目前，基因治療的重點集中在抑制肝星形細胞活性、靶向調(diào)節(jié)MMPs∕TIMPs 及控制炎癥反應這三方面。本研究主要以抑制TIMPs 為方向，分析基因治療的臨床價值及可行性。

基因治療的效應高低依賴于載體，以往所用載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等。其中，腺病毒因其具有細胞感染性強、感染條件少、基因承載量大、無插入突變型及滴度高等優(yōu)勢成為當前基因治療的常見載體。夏冬等［13］將攜帶人TIMP-1 的重組腺病毒轉(zhuǎn)染至肝癌Hepc2 細胞后，發(fā)現(xiàn)該載體對癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移均有明顯抑制作用，此結論進一步肯定了基因治療的益處，但在隨后沈宇宙等［14］的研究中可以看到，重組腺病毒載體亦存在毒性副作用、靶向性差且機體轉(zhuǎn)染效率低等不可忽視的缺陷。因此，尋找安全無毒兼有靶向高轉(zhuǎn)染率的理想載體成為基因治療肝纖維化的又一難題。聲學微泡屬于新型的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染非病毒載體，是近年來的研究熱點，其使用方便，能克服常規(guī)載體的不足，亦能針對性調(diào)節(jié)劑量和強度；此外其還能在運輸過程中保護目的基因∕藥物，極具研究價值［15］。本研究所用重組腺病毒超聲微泡混合劑的粒徑大小、分散度、濃度同一般聲學微泡相似，符合轉(zhuǎn)染要求，鏡下熒光強度較好，可見其制備簡單、感染力強、性狀穩(wěn)定。對比常規(guī)腺病毒載體，超聲微泡聯(lián)合超聲輻照的轉(zhuǎn)染率更強。與重組腺病毒超聲造影劑及重組腺病毒聯(lián)合超聲輻照這兩種轉(zhuǎn)染方式相比，其轉(zhuǎn)染率仍處于較高水平，所介導的目的基因能夠在特定組織中穩(wěn)定表達。上述現(xiàn)象提示超聲微泡需聯(lián)合超聲輻照才可成為較為理想的轉(zhuǎn)染載體。一定強度的超聲輻照利于靶向運輸，外殼表面黏附著腺病毒的微泡在輻照的作用下逐漸膨脹，達到臨界值時，微泡破裂，靶基因釋放于肝細胞內(nèi)。而由微泡的破裂引起的局部高壓可導致細胞膜通透性增高，促使攜帶靶基因的重組腺病毒更為容易的通過破裂的毛細微血管和細胞膜，以此增強了目的基因的轉(zhuǎn)染率和劑量［16］。

成功進入細胞是基因治療的關鍵步驟，而介導的靶基因發(fā)揮治療作用則是最終目的。筆者檢測了大鼠組織病理學指標及相應蛋白的變化，據(jù)此評估轉(zhuǎn)染的靶基因?qū)Ω卫w維化大鼠的治療效果。結果顯示，成功轉(zhuǎn)染了shTIMP-1 的大鼠肝纖維化程度得以改善，肝纖維化等級較輕，相應的血清指標ALT、AST、HA 及LN 活性也比其他轉(zhuǎn)染方案者低，提示超聲微泡靶向的下調(diào)TIMP-1 基因表達載體與超聲輻照聯(lián)合轉(zhuǎn)染后，發(fā)揮作用的靶基因高于常規(guī)腺病毒載體及腺病毒超聲造影劑混合物單獨應用。Western blot 檢測結果表明，與其他處理措施相比，腺病毒超聲造影劑聯(lián)合超聲輻照治療后，肝纖維化大鼠的TIMP-1 蛋白表達更高，MMP-13 蛋白表達更低。在肝纖維化形成過程中，TIMP-1 起著十分重要的作用，可通過抑制MMP-1、MMP-13 活性，減慢細胞外基質(zhì)的降解，推進肝纖維化的發(fā)生［17］。故封閉TIMP-1 表達即可釋放MMP-13 活性，在一定程度上逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

由于課題內(nèi)容較多，預實驗摸索有限，本研究所選定的超聲微泡的濃度和超聲輻照的強度均是參考公司往期實驗結論，未曾細分探討各濃度或強度下轉(zhuǎn)染效率的高低。加之，納入分析的TIMP-1 上下游分子不夠全面，對實驗結果可能有一定干擾。筆者將在日后的研究中針對上述不足進行改正，以驗證我們的結論。

綜上，超聲微泡微泡靶向TIMP-1 下調(diào)的腺病毒治療能抑制TIMP-1 活性，改善肝纖維化程度，基因治療具有潛在應用價值。