肺癌晚期患者不同基因突變、融合或擴(kuò)增的相關(guān)性

姚源山 周銀杰 楊振華 華青旺 沈海波

寧波市第二醫(yī)院胸外科（浙江寧波315000）

近年來肺癌的發(fā)病率和病死率逐步上升，據(jù)中國國家癌癥中心2015年數(shù)據(jù)，我國肺癌發(fā)病率、病死率在各癌種中均居首位［1］。已證實(shí)肺癌與吸煙之間存在關(guān)聯(lián)，但越來越多的證據(jù)已經(jīng)指向遺傳易感性介導(dǎo)，因此分子學(xué)檢測與歸類可以進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化治療方案。根據(jù)近期一個(gè)100 份NSCLC 腫瘤樣本的全外顯子測序報(bào)告，其中包括測試編碼表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因和BRAF 基因V600E 的突變，尋找間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）和大鼠骨肉瘤（ratosteosarcoma，ROS7）編碼基因的易位，以及新近添加的評(píng)估程序性死亡受體配體1（programmed death-1，PD-L1）的表達(dá)等［2］。目前分子靶向治療是臨床研究的熱點(diǎn)，而以往的靶點(diǎn)研究只注重單個(gè)基因的突變、擴(kuò)增或融合，然而疾病的發(fā)生往往非單一因素，多個(gè)基因之間具有一定的相關(guān)性，本研究進(jìn)一步深入的探討基因之間的關(guān)聯(lián)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)燃石朗克TM基于第二代測序技術(shù)與南京世和基因生物技術(shù)有限公司主研發(fā)的Lung Trak panel，檢測NCCN 指南中明確與非小細(xì)胞肺癌個(gè)性化治療方案高度相關(guān)的基因突變、重排及拷貝數(shù)變化。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)病理學(xué)診斷確診為NSCLC 患者，細(xì)胞塊標(biāo)本來源于胸水、血液、血漿，組織塊標(biāo)本來源于肺穿、胸膜和手術(shù)標(biāo)本。

1.3 一般資料 收集我院信息系統(tǒng)（HIS）院病理科進(jìn)行基因檢測的NSCLC 患者共630 例患者，男430 例，年齡20 ～86 歲，平均（53.46 ± 13.12）歲，中位年齡60 歲；女200 例，平均（56.36±16.64）歲，中位年齡56 歲。

1.4 數(shù)據(jù)提取及預(yù)處理 利用SQL Server 管理工具從浙江寧波市第二醫(yī)院臨床數(shù)據(jù)庫中將入選患者的住院病歷的全部數(shù)據(jù)進(jìn)行提取、轉(zhuǎn)換，建立新的數(shù)據(jù)庫。將EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、RET、ROS1、KRAS 等8 個(gè)NCCN 指南中明確與非小細(xì)胞肺癌個(gè)性化治療方案高度相關(guān)的以及重復(fù)出現(xiàn)的基因按突變、擴(kuò)增、及融合排序分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及數(shù)據(jù)挖掘 （1）采用Excel 2016建立數(shù)據(jù)庫，分析不同基因以及突變、擴(kuò)增及融合頻率，歸納總結(jié)規(guī)律。（2）患者核心基因情況采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，根據(jù)基因出現(xiàn)配伍網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)度以及節(jié)點(diǎn)配伍的權(quán)重分布，發(fā)現(xiàn)處方配伍網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)及其配伍。（3）關(guān)聯(lián)規(guī)則分析采用IBM Modeler 14.2 中的Apriori 模塊為挖掘工具來探討基因之間的關(guān)系，置信度為50%，支持度設(shè)置為10%。（4）利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 630例NSCLC患者前26位基因情況 高頻率出現(xiàn)的有26 位基因（表1）。其中EGFR-19 突變、ALK 融合、RET 突變、EGFR-L858R-21 突變、ALK 突變、T790M 突變?yōu)榍? 位（圖1）；前26 位中NRASG12D 突變與BRAF-G466V 突變、MYC-R450W 突變與CYP2D6 突變、GATA3M423fs 突變與ESR1 突變、SRC 突變與GATA3M423fs 突變、SRC 突變與ESR1突變分類值之間共現(xiàn)頻率網(wǎng)絡(luò)圖形具有，見圖2。

表1 630 例NSCLC 患者前26 位基因情況Tab.1 The first 26 genes in 630 patients with NSCLC

圖1 前6 位突變分類值頻率網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Frequency network diagram of the first six mutation classification values

圖2 前26 位突變分類值頻率網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Frequency network diagram of the first 26 mutation classification values

2.2 基因關(guān)聯(lián)分析 設(shè)置最小為50%，支持度設(shè)置為10%，經(jīng)Apriori 模塊分析，以支持度排名取值，見表2。

表2 藥物二相關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Tab.2 Analysis of two phase association rules of drugs

2.3 基因聚類分析 一般認(rèn)為同類樣本之間距離越小，不同類樣本之間距離越大。本文使用系統(tǒng)聚類方法針對(duì)頻率前26 位進(jìn)行聚類分析，見圖3。基因聚類結(jié)果分析，見表3。

圖3 基因系統(tǒng)聚類樹狀圖Fig.3 Cluster dendrogram of gene system

表3 基因聚類結(jié)果分析Tab.3 Analysis of genetic clustering results

3 討論

有研究［3］表明肺癌化療效果及預(yù)后生存可能與相關(guān)基因變異及表達(dá)水平有關(guān)，近年來相關(guān)研究已經(jīng)取得了重大突破，某個(gè)基因的缺失、突變、擴(kuò)增以及融合與肺癌發(fā)病率明顯相關(guān)，不同基因型的晚期NSCLC 患者的預(yù)后差異也較大［4-5］。因細(xì)胞毒藥物應(yīng)答與單個(gè)基因標(biāo)志物的相關(guān)性較弱，因此首先尋找基因之間的關(guān)聯(lián)性可以聯(lián)合用藥提高療效及預(yù)后生存［6］。高頻率出現(xiàn)的有26 位基因與SHAW 等［7］通過對(duì)馬薩諸塞總醫(yī)院650 例肺腺癌患者進(jìn)行篩查得到的結(jié)果基本一致，基因分型檢測出在KRAS ＞EGFR ＞PI3K ＞HER2 ＞BRAF ＞AKT ＞NRAS。此外，熒光原位雜交技術(shù)被用來鑒定涉及ALK 或ROS 的染色體重排，以及c-MET 基因擴(kuò)增。

本研究將EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、RET、ROS1、KRAS 等8 個(gè)基因通過共現(xiàn)頻率網(wǎng)絡(luò)圖形發(fā)現(xiàn)，BRAFG464V 突變與KRAS G12A 突變、KRAS G12D突變，ERBB2 S310F突變與KRAS G12D突 變，BRAF-G466V 突 變 與ERBB2 S310F 突 變、KRAS G12A突變、KRAS G12D突變，具有關(guān)聯(lián)性，因此臨床靶向用藥時(shí)可重點(diǎn)排查和預(yù)防。BRAF突變多見于女性、肺腺癌患者，BRAF突變或融合基因的NSCLC 可能對(duì)BRAF 抑制劑和MEK 抑制劑敏感［8］。但攜帶BRAF 基因突變的腫瘤可能對(duì)選擇性BRAF抑制劑不敏感。KRAS 突變的NSCLC 患者的預(yù)后差，是肺癌獨(dú)立的預(yù)后因子［9］。攜帶KRAS 突變的腫瘤可能對(duì)EGFR、BRAF、MET、ALK 等靶點(diǎn)抑制劑耐藥，但可能對(duì)MEK 抑制劑和CDK4∕6 抑制劑敏感。BRAF 突變與KRAS 突變關(guān)系與相關(guān)報(bào)道一致［10］。ERBB2突變，可作為評(píng)價(jià)肺腺癌和鱗癌惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的有效指標(biāo)之一，而晚期NSCLC 對(duì)ERBB2 抑制劑敏感［11］。前26 位中NRAS-G12D 突 變 與BRAF-G466V 突 變、MYCR450W 突變與CYP2D6 突變、GATA3M423fs 突變與ESR1 突變、SRC 突變與GATA3M423fs 突變、SRC 突變與ESR1突變分類值之間具有關(guān)聯(lián)性。

根據(jù)基因關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，可知EGFR-19突變與14 基因缺失，EGFR-19 突變與T790M 突變，EGFR-19 突變與TP53 突變，ROS1 融合與MET 擴(kuò)增，MET擴(kuò)增與ROS1融合，T790M突變與EGFR擴(kuò)增，EGFR-19 突變與EGFR 擴(kuò)增，支持度以此降低。EGFR 基因與其他基因的關(guān)聯(lián)性密切，因此在針對(duì)其他基因靶向用藥是應(yīng)該注重EGFR 基因的導(dǎo)向性。（NCCN?）腫瘤臨床實(shí)踐指南指出，攜帶某些EGFR突變的腫瘤對(duì)一∕二代EGFR-TKI 敏感。攜帶某些EGFR 突變的腫瘤可能對(duì)一∕二代EGFR-TKI 耐藥，但對(duì)三代EGFR-TKI 敏感。研究顯示［12］，T790M 突變是在TKI 長期治療過程中保留下的基因改變，它在疾病進(jìn)展前6個(gè)月到進(jìn)展后4個(gè)月表達(dá)陽性率進(jìn)行性升高，同時(shí)伴有EGFR 敏感突變（19 外顯子缺失或21外顯子L858R）陽性率的大幅增加。杜亞茜等［13］研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變多見于有TKI用藥史且服藥時(shí)間＞6個(gè)月的晚期NSCLC患者。攜帶EGFR20 號(hào)外顯子插入突變的腫瘤可能對(duì)現(xiàn)有EGFRTKI 都不敏感，針對(duì)性TKI 正在早期研發(fā)中。攜帶EGFR擴(kuò)增的肺鱗癌可能對(duì)抗-EGFR抗體敏感。因此在關(guān)聯(lián)基因同時(shí)靶向用藥可能會(huì)降低對(duì)一∕二代EGFR-TKI耐藥將是后期的研究方向。

本文使用系統(tǒng)聚類方法針對(duì)頻率前26 位進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果有9 組，有研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)BRAF 和NRAS mRNA 量和蛋白表達(dá)量與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)性［14］。MET 擴(kuò)增與ROS1 融合在以往的臨床極少發(fā)現(xiàn)，但并不完全排除共存，朱衛(wèi) 東等［15］發(fā)現(xiàn)1 例患者 同 時(shí)存 在MET 擴(kuò) 增 和ROS1 基因重排，這與本研究結(jié)果一致。BRAF 是EGFR 下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號(hào)分子，聯(lián)合檢測NSCLC 腫瘤組織EGFR 與BRAF 可對(duì)篩選EGFR-TKI 受益人群有幫助。

本次回顧性研究具有一定的局限性，如例數(shù)太少、統(tǒng)計(jì)誤差等，或許還有更多相關(guān)性基因由于例數(shù)少未顯示出來，但臨床發(fā)病往往非單一因素，本研究通過計(jì)算機(jī)輔助分析的結(jié)果具客觀性，為臨床用藥提供了參考，具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。