惠州地區(qū)β缺失型地貧的基因診斷及臨床特征分析*

鐘澤艷， 陳劍虹， 官志揚， 賀海林， 鐘國興， 楊坤祥

惠州市婦幼保健計劃生育服務中心產(chǎn)前診斷中心(廣東惠州 516007)

β地中海貧血(以下簡稱β地貧)是我國南方最常見的單基因遺傳病之一，是一種由于珠蛋白基因表達缺陷導致的珠蛋白鏈合成減少或缺如的溶血性貧血疾病[1]。β珠蛋白基因簇位于11號常染色體的短臂，常見的β地貧主要是由于β珠蛋白基因簇的點突變引起，只有少數(shù)是因β珠蛋白基因簇的大片段缺失(稱β缺失型地貧)。β缺失型地貧主要見于δβ地貧，其特征是由于基因發(fā)育表達失控引起的胎兒出生后血紅蛋白F(hemoglobin,HbF)持續(xù)增高，且存在遺傳異質(zhì)性大[2-3]。研究報道，在我國最常見的β缺失型地貧主要有3種，分別為東南亞型HPFH(SEA-HPFH)、中國型Gγ(Aγδβ)0、中國臺灣型(Taiwanese)[2-4]。在廣東省的大樣本地貧基因攜帶率的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，惠州地區(qū)的地貧基因攜帶率(17.50%)明顯高于全省的平均水平(16.83%)[5]。因此，地貧防控的有效實施與完善對于提高惠州市人口的健康水平和質(zhì)量具有重大意義。本研究利用廣東省孕前和孕期優(yōu)生健康檢查信息管理平臺，以惠州市政府“民生工程”為背景，分析惠州地區(qū)育齡夫婦人群中SEA-HPFH、中國型Gγ(Aγδβ)0和Taiwanese缺失地貧的基因攜帶率及臨床特征等流行病學資料，完善惠州地區(qū)人群地貧防控模式，為本市的優(yōu)生優(yōu)育工作提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年10月至2017年11月，參加惠州市孕前和孕期優(yōu)生健康檢查的育齡夫婦，通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準及知情同意的原則，符合免費政策要求在本院進行地貧基因分析的受檢者39 170例。年齡(26±5.31)歲，近3個月無輸血史，均來源于惠州市的六大縣區(qū)(惠城區(qū)、惠東縣、博羅縣、龍門縣、大亞灣和仲愷高新區(qū))。

1.2 樣本采集 在知情同意的原則下，抽取受檢者外周血兩管(2 mL/管)，一管使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，用于血常規(guī)檢測。一管使用枸櫞酸鈉(ACD)抗凝，用于血紅蛋白(hemoglobin，Hb)電泳分析和地貧基因分析。同時，本中心對可能會分娩中、重型地貧患兒的孕婦行產(chǎn)前診斷。

1.3 研究方法

1.3.1 血常規(guī)檢測 采用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的BC-5380全自動五分類血液細胞分析儀檢測紅細胞參數(shù)，包括Hb、紅細胞平均體積 (mean corpuscular volume，MCV)及紅細胞平均血紅蛋白含量 (mean corpuscular hemoglobin，MCH)等。采用廠家原裝配套試劑，其中外院樣本的血常規(guī)檢測在當?shù)貐^(qū)縣的醫(yī)院完成并將數(shù)據(jù)報送我院。

1.3.2 Hb電泳分析 采用法國Sebia公司的Capillarys 2 flex piercing全自動毛細管電泳儀分析Hb組分。分析內(nèi)容主要包括血紅蛋白A(hemoglobin A，HbA)、血紅蛋白A2(hemoglobin A2，HbA2)和HbF等。當HbA2>3.50%和(或)HbF>2.50%，判定為β地貧表型陽性[5-6]。采用廠家原裝配套試劑，其中部分外院樣本的Hb電泳分析在當?shù)貐^(qū)縣的醫(yī)院完成并將數(shù)據(jù)報送我院。正常參考值：Hb為120～160 g/L(男)、110～150 g/L(女)，MCV為82～100 fL，MCH為27～34 pg，HbA2為2.5%～3.5%，HbF<2.5%。

1.3.3 地貧基因分析 按全血基因組DNA提取試劑盒說明書，采用廈門百維信生物公司的Lab-Aid 820 核酸提取儀提取基因組DNA。獲得的DNA應用亞能生物技術(shù)有限公司和中山大學達安基因股份有限公司的地貧基因檢測試劑盒進行基因檢測。檢測范圍為中國人常見的3種α缺失型地貧(--SEA/、-α4.2/、-α3.7/)，3種α非缺失型地貧(HBA2:c.369C>G、HBA2:c.377T>C、HBA2:c.427T>C)，17種β地貧(HBB:c.126_129delCTTT、HBB:c.52A>T、HBB:c.130G>T、HBB:c.216_217insT、HBB:c.92+1G>T、HBB:c.92+5G>C、HBB:c.316-197C>T、HBB:c.-78A>C、HBB:c.-79A>G、HBB:c.-80T>C、HBB:c.-82C>A、HBB:c.-11_-8delAAAC、HBB:c.2T>G、HBB:c.45_46insG、HBB:c.84_85insC、HBB:c.79G>A、HBB:c.94delC)。按照操作說明書進行實驗操作和結(jié)果判斷。對疑為β地貧而未檢出常見突變基因的樣本，進一步采用裂縫聚合酶鏈反應(Gap polymerase chain reaction, Gap-PCR)技術(shù)檢測SEA-HPFH缺失、中國型Gγ(Aγδβ)0缺失、Taiwanese缺失，目的片段長度分別為420、330、670 bp。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)基因型及β缺失型地貧結(jié)果 在39 170例血液樣本中，根據(jù)血液學篩查陽性樣本的納入標準，判定為β地貧表型陽性而未檢出常規(guī)基因型的樣本有364例，所占比例為0.93%。在364例加測樣本中檢出β缺失型地貧105例，檢出率為0.27%。包括SEA-HPFH缺失62例，中國型Gγ(Aγδβ)0缺失41例和Taiwanese缺失2例，其中復合α地貧有13例。其中檢出6例樣本的配偶同為β地貧攜帶者，屬夫妻同型地貧攜帶者，進行產(chǎn)前診斷。具體結(jié)果和基因型別見圖1、表1。

2.2 β缺失型地貧攜帶者的血液學特征 3種β缺失型地貧攜帶者的血常規(guī)檢測結(jié)果均表現(xiàn)為小細胞低色素，但貧血癥狀較輕或無貧血。Hb電泳分析：SEA-HPFH缺失地貧攜帶者大部分樣本的HbA2高于正常值3.5%，HbF呈現(xiàn)明顯增高；但中國型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧攜帶者則不同于常見β地貧點突變攜帶者，全部表現(xiàn)為HbA2不增高，而HbF與SEA-HPFH缺失地貧攜帶者一樣明顯增高；與前兩者不一樣，Taiwanese缺失地貧攜帶者雖然HbA2增高，但HbF沒有明顯的增高。見表2。

1：Marker,2～4：樣本；5：陰性對照；6～8：陽性對照；9：空白對照

圖1 β缺失型地貧電泳結(jié)果

2.3 不同組別的血液學特征 比較SEA-HPFH缺失雜合子和中國型Gγ(Aγδβ)0缺失雜合子的血液學特征，通過正態(tài)性檢驗，6組數(shù)據(jù)除了HbA2為非正態(tài)分布，其余5組數(shù)據(jù)均為正態(tài)性分布。統(tǒng)計學分析，HbA2數(shù)據(jù)組的U值為176.00(P=0.000)，其余5組數(shù)據(jù)組詳見表3。比較分析發(fā)現(xiàn)，除了Hb數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其他包括MCV、MCH、HbA、HbA2和HbF的5組數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 β缺失型地貧基因型分布

β-1為SEA-HPFH，β-2為Gγ(Aγδβ)0，β-3為Taiwanese

項目例數(shù)Hb(g/L)MCV(fL)MCH(pg)HbA(%)HbA2(%)HbF(%)SEA-HPFH缺失62129.23±17.4677.27±5.7125.44±1.8277.61±5.983.68±0.7918.71±6.08Gγ(Aγδβ)0缺失41128.32±15.6772.64±5.1624.05±2.2682.55±4.842.42±0.3115.03±4.89Taiwanese缺失2115.00±8.4971.85±7.1422.75±3.1891.31±0.045.09±1.413.60±1.37

項目例數(shù)Hb(g/L)MCV(fL)MCH(pg)HbA(%)HbF(%)SEA-HPFH雜合子54130.05±17.4978.16±5.4825.76±1.7177.09±6.1919.31±6.25Gγ(Aγδβ)0雜合子36127.89±15.5272.64±5.3423.98±2.3882.58±5.0615.02±5.12U值0.5994.7274.121-4.6043.430P值0.5510.0000.0000.0000.001

3 討論

δβ地貧屬于β缺失型地貧，是一組血紅蛋白病。β缺失型地貧雜合子與β地貧點突變雜合子婚配后，有1/4的機會可能生育中、重型β地貧患兒的風險，是地貧防控的重點類型[7-8]。目前通過人群篩查，對同型夫婦這類高風險家庭行產(chǎn)前診斷，防止中、重型地貧患兒的出生，是目前國內(nèi)公認的首選有效措施。

本研究中，惠州地區(qū)39 170例樣本中檢出105例β缺失型地貧患者，攜帶率高達0.27%。其中SEA-HPFH占59.05%，中國型Gγ(Aγδβ)0占39.05%和Taiwanese占1.90%。β缺失型地貧攜帶者的紅細胞參數(shù)結(jié)果表現(xiàn)為無貧血或輕度貧血，Hb為109～161 g/L，但有明顯的小細胞低色素特征，MCV、MCH顯著下降，這與文獻報道的結(jié)果相類似[7-10]。在Hb電泳結(jié)果中，SEA-HPFH和中國型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧攜帶者都表現(xiàn)了明顯的高水平HbF(5.15%～36.48%)。與常見β地貧點突變攜帶者[11-13]相比較，SEA-HPFH缺失地貧攜帶者大部分的HbA2升高，但中國型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧攜帶者卻表現(xiàn)出HbA2不增高。該明顯的血液學特征與前期文獻報道的一致[2,6-7,14]，且血液學參數(shù)范圍更大。分析原因，除了因存在個體差異性大，可能由于大樣本研究，樣本來源較多地區(qū)，血液學檢查的質(zhì)控和所用儀器存在一定的差異性。此外，研究發(fā)現(xiàn)SEA-HPFH和中國型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧主要收集于惠東縣、博羅縣和惠城區(qū)3個地區(qū)，特別是惠東縣的檢出率明顯高于其他地區(qū)，可能因地區(qū)人群差異性所導致?；輺|縣人口組成以客家人為主，這支持了前期報道的“地貧主要分布于客家人，隨著客家人祖先的南遷和漂泊傳遞到世界地區(qū)”的推論[15]。與前兩者不一樣，Taiwanese缺失地貧攜帶者雖然HbA2增高，但HbF沒有明顯的增高。不過因該基因型別檢出樣本例數(shù)較小，血液學特征需后期獲取更多的陽性樣本進一步研究加以驗證。統(tǒng)計學比較分析SEA-HPFH缺失雜合子和中國型Gγ(Aγδβ)0缺失雜合子的血液學特征，6組數(shù)據(jù)中除了Hb組的其他組數(shù)據(jù)均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與早期的報道情況一致。

本研究中，3種β缺失型地貧患者的臨床癥狀較輕，其中13例復合了α地貧的樣本臨床癥狀更是有所緩解，但當復合其他β地貧時，患者會出現(xiàn)中度至重度貧血，臨床表型類似于中、重型β地貧[9-10,16]。因此，檢測出6例為SEA-HPFH和中國型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧且其配偶同為β地貧者，在知情同意情況下均行產(chǎn)前診斷，分別檢測出3例正常胎兒、2例β地貧攜帶者及1例中國型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧復合β地貧雙重雜合子胎兒。其中復合β地貧的胎兒經(jīng)遺傳咨詢后，該例患者選擇終止妊娠。雖然中國人群中，β地貧主要是因β珠蛋白基因的點突變所致，但本研究發(fā)現(xiàn)惠州地區(qū)人群的β缺失型地貧攜帶率也不低，特別是SEA-HPFH和中國型Gγ(Aγδβ)0缺失地貧是比較常見的類型。目前國內(nèi)各分子實驗室常規(guī)應用的基因檢測技術(shù)僅檢測17種點突變引起的β地貧，不包括β缺失型地貧。對于β缺失型地貧會漏診，從而導致中、重型β地貧患兒的出生。因此，若篩查中血液學參數(shù)顯示為小細胞低色素性貧血，而常規(guī)地貧基因未檢出，并伴有HbF明顯升高，尤其是當HbF>5%時，應考慮β缺失型地貧的可能[6-7]。同理，一個家系中只檢測出一個常規(guī)地貧基因突變，卻生育出了重型β地貧患兒，應考慮β缺失型地貧的可能?？傊谂R床遺傳咨詢中要嚴格遵循血液學表型與基因型相結(jié)合的分析原則，并注意和重視β缺失型地貧的篩查及診斷，預防誤診或漏診，保證臨床診斷的準確性。

綜上所述，惠州地區(qū)β缺失型地貧攜帶率高，地貧防控應同時行血常規(guī)檢測和Hb電泳分析。針對于β缺失型地貧的正確診斷，可為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供更好的依據(jù)。本研究中，采集樣本量較多，來源較廣，檢測質(zhì)量的把控需進一步完善統(tǒng)一的管理文件，且惠州地區(qū)存在多種民族，對于少數(shù)民族的基因型特征分布情況有待進一步研究，完善地貧數(shù)據(jù)庫。