基于NF-κB通路研究自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病過程中相關(guān)因子的表達(dá)變化*

祁崗， 朱艷媚， 李玉娟， 李焱， 羅世文， 李曼

1青海省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科(青海西寧 810007)； 2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院(青海西寧 810016)

自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)是人類常見的器官特異性自身免疫性疾病，其發(fā)病部位主要位于甲狀腺，主要包括Graves病(GD)和橋本甲狀腺炎(Hashimotos thyroiditis,HT)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制包括遺傳因素和環(huán)境因素，兩者共同作用導(dǎo)致免疫失衡和信號(hào)通路異常，形成自身免疫性炎癥[2-4]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性甲狀腺疾病和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎中，存在明顯的免疫失衡和信號(hào)通路的異常[5-7]。有研究發(fā)現(xiàn)在AITD組織中核因子-κB(NF-κB)通路被異常激活[8]，但并未有對(duì)NF-κB通路在AITD發(fā)病過程中不同階段的激活情況以及與炎癥相關(guān)因子的關(guān)系進(jìn)行研究，因此,2016年11月至2017年10月,本研究通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)探索NF-κB通路在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎中不同階段激活情況以及與相關(guān)炎癥因子的關(guān)系，為自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 150只雄性清潔級(jí)昆明小鼠購買自蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重 35～55 g，飼養(yǎng)條件：12 h晝夜交替，溫度23℃，按需攝入食水。SPF級(jí)CBA/j小鼠購買自北京華阜康生物科技股份有限公司，體重14～20 g，飼養(yǎng)條件：12 h晝夜交替，溫度23℃，按需攝入食水。Sephadex G-200凝膠(索萊寶生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，SP9001免疫組化試劑盒、RIPA裂解液、超敏型ECL檢測(cè)試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳液以及蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)膜液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；NF-κB、IKK抗體均屬于兔單克隆抗體(Abcam公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(CST公司)，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Takara)，引物(Takara公司)。引物信息：TNF-α：上游5′-CCTCTAGCCCACGTCGTAGC-3′， 下游5′-AGCAATGACTCCAAAGTAGACC- 3′；Bcl-2：上游5′-TGACCCGCAGCAAGAAAGTG-3′，下游5′-ATCTGTGGAGAAGACAGCTA-3′；細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)：上游5′ -GACCACGGAGCCAA-TTTCTCA-3′，下游5′ -TCCAGTTCCCCAAG- CAGTCC-3′；β-actin：上游5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游5′-TAAAACGCA GCTCAGTAACAGTCCCG-3′。

1.2 方法

1.2.1 mTg蛋白純化 取昆明小鼠150只，剝離甲狀腺組織，并迅速置于4℃預(yù)冷0.01 mmol/L 的pH 7.2的PBS中。研磨成勻漿液。經(jīng)4℃ 3 000 r/min離心30 min，取上清，再經(jīng)4℃ 10 000×g離心1 h，取上清液經(jīng)飽和度為42%、37%和42%硫酸銨3次沉淀后，溶于PBS中， 4℃透析48 h，換液6次，凍干，溶于洗脫液，經(jīng)Sephadex G-200凝膠層析純化。

1.2.2 mTg蛋白鑒定 將純化的蛋白加入4×上樣緩沖液，煮沸變性后，加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離，然后用考馬斯亮藍(lán)R250染色，根據(jù)條帶的分子量鑒定是否為甲狀腺球蛋白。

1.2.3 動(dòng)物飼養(yǎng)及造模 于8周齡時(shí)，給予CBA/j小鼠mTg+CFA皮下注射初次免疫，10周齡時(shí)模型組再給予相同mTg+IFA重復(fù)免疫1次，分別于初次免疫后第0、1、2周以及加強(qiáng)免疫后第2周齡時(shí)處死小鼠，取血清及甲狀腺組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 HE染色 摘取甲狀腺組織，PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定1周后，經(jīng)脫水后，石蠟包埋，切成4 μm切片。進(jìn)行HE染色，簡(jiǎn)要步驟如下：依次經(jīng)二甲苯、梯度酒精水化后，蘇木素浸染5 min，鹽酸乙醇分色，自來水沖洗，伊紅浸染2～3 min、脫水、透明及封片，光鏡觀察并照相。參考Tang等[9]的炎癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，光鏡下觀察甲狀腺組織的炎癥細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞)浸潤程度，并參考Tang等[9]的炎癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1.2.5 ELISA實(shí)驗(yàn) 眼球取血后，將血液于室溫放置30 min，待其凝固后，3 000 r/min離心10 min，取血清，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)要如下：按照說明書，分為標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、樣品孔。在標(biāo)準(zhǔn)孔中加入梯度標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各部操作相同，樣品孔中加入稀釋5倍的樣品，37℃溫浴30 min，洗滌液洗5次，加入酶標(biāo)試劑，溫浴30 min，洗滌液洗滌5次，顯色15 min，終止反應(yīng)，450 nm波長測(cè)量各孔OD值。

1.2.6 qPCR實(shí)驗(yàn) 將甲狀腺組織在Trizol中快速研碎，室溫靜置5 min，13 000 r/min離心5 min，吸取上清，加入氯仿，靜置離心，吸取上清加入異丙醇，靜置離心，棄去上清，75%乙醇清洗沉淀，離心棄上清，保留沉淀干燥，用DEPC水溶解。然后按照Takara反應(yīng)試劑盒依次經(jīng)過去除基因組DNA反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性：95℃、10 min、1循環(huán)數(shù)；擴(kuò)增：95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、30 s、40循環(huán)數(shù)。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 甲狀腺組織中加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至勻漿后，4℃放置30 min，13 000 r/min離心10 min，取一部分上清，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，另一部分上清加入4×上樣緩沖液，煮沸變性后，加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離，再經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、4℃孵育一抗、室溫孵育二抗、ECL發(fā)光液顯色、X醫(yī)用膠片顯影、定影等步驟，最后進(jìn)行拍照分析。

1.2.8 免疫組化實(shí)驗(yàn) 按照SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。甲狀腺組織切片經(jīng)過抗原熱修復(fù)、封閉、孵育一抗、生物素標(biāo)記的二抗。PBS沖洗，3 min×3次。將辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液滴加適量于切片的組織上，37℃孵育10 min。PBS 沖洗，3 min×3次。經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、0.5%的鹽酸酒精分化后，將切片脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白純化及鑒定 由圖1可知，在純化mTg過程中，圖1-A中第1個(gè)峰代表丙酮分子，單一平滑表明柱子安裝合格。第2個(gè)峰圖代表分離純化的甲狀腺球蛋白，在甲狀腺中，甲狀腺球蛋白分子量是最大的，因此第2個(gè)峰推測(cè)即為甲狀腺球蛋白，進(jìn)行收集。為驗(yàn)證是否為甲狀腺球蛋白，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，圖1-B中3條帶為稀釋不同濃度的收集的純化蛋白，根據(jù)分子量顯示分析為甲狀腺球蛋白且蛋白純度較高，達(dá)到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模的要求。

A：純化峰圖；B：電泳鑒定圖

2.2 病理變化 與初次免疫第0周小鼠甲狀腺組織相比，初次免疫后第1周甲狀腺組織可見炎癥細(xì)胞的輕微浸潤，炎癥評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但甲狀腺濾泡體積、數(shù)量、形狀以及濾泡間壁膜厚度并未發(fā)生變化；初次免疫后第2周(即2次加強(qiáng)免疫時(shí))，小鼠甲狀腺組織濾泡間壁膜厚度增加，體積、形狀以及數(shù)量并未發(fā)生明顯變化，組織中可見較多炎癥細(xì)胞浸潤，與0周小鼠甲狀腺炎癥評(píng)分相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強(qiáng)免疫后第2周)，甲狀腺組織濾泡體積減小、數(shù)量減少，濾泡間壁膜厚度明顯增加，組織中可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，與0周小鼠甲狀腺炎癥評(píng)分相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2和表1。

A:0周；B:1周；C:2周; D：4周

時(shí)間n病理評(píng)分F值P值0周40.50±0.5822.60.0001周41.50±0.58?2周42.75±0.50?4周43.50±0.58?

*與0周比較P<0.05

2.3 血清中TNF-α含量變化 與初次免疫第0周小鼠血清中TNF-α含量相比，初次免疫后第1周小鼠血清中TNF-α含量有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；初次免疫后第2周(即2次加強(qiáng)免疫時(shí))，小鼠血清中TNF-α含量顯著增高，與0周小鼠血清中TNF-α含量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強(qiáng)免疫后第2周)，小鼠血清中TNF-α含量進(jìn)一步增高，與0周小鼠血清中TNF-α含量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

時(shí)間nTNF-α含量F值P值0周477.07±13.1968.4980.0001周492.38±8.812周4138.68±13.62?4周4188.14±12.22?

*與0周比較P<0.05

2.4 甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化 與初次免疫第0周小鼠甲狀腺組織中TNF-α mRNA、Bcl-2 mRNA以及ICAM-1 mRNA含量相比，初次免疫后第1周小鼠甲狀腺組織中三者含量均有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；初次免疫后第2周(即2次加強(qiáng)免疫時(shí))，小鼠甲狀腺組織中TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA含量顯著增高，與初次免疫0周小鼠相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bcl-2 mRNA含量有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強(qiáng)免疫后第2周)，小鼠甲狀腺組織中TNF-α mRNA、Bcl-2 mRNA以及ICAM-1 mRNA含量進(jìn)一步增高，與初次免疫0周小鼠相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

項(xiàng)目nTNF-αBcl-2ICAM-10周41.00±0.001.00±0.001.00±0.001周41.04±0.161.01±0.051.03±0.082周41.44±0.10?1.07±0.111.39±0.08?4周41.76±0.06?1.50±0.08?1.66±0.09?F值51.40144.14677.905P值0.0000.0000.000

*與0周比較P<0.05

2.5 甲狀腺組織中NF-κB蛋白變化 與初次免疫第0周小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量相比，初次免疫后第1周小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；初次免疫后第2周(即2次加強(qiáng)免疫時(shí))，小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量顯著增高，與初次免疫0周小鼠甲狀腺中NF-κB蛋白含量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強(qiáng)免疫后第2周)，小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量進(jìn)一步增高，與0周小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 甲狀腺組織中NF-κB蛋白變化

2.6 甲狀腺組織中IKK蛋白變化 與初次免疫第0周小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量相比，初次免疫后第1周小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量有所

時(shí)間n相對(duì)含量F值P值0周40.30±0.08172.7470.0001周40.33±0.062周41.30±0.10?4周41.31±0.10?

*與0周比較P<0.05

上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；初次免疫后第2周(即2次加強(qiáng)免疫時(shí))，小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量顯著增高，與初次免疫0周小鼠甲狀腺中IKK蛋白含量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強(qiáng)免疫后第2周)，小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量進(jìn)一步增高，與0周小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4和表5。

A:0周；B:1周；C:2周；D:4周

時(shí)間n相對(duì)表達(dá)量F值P值0周40.276 5±0.0950.44 60.0001周40.377 5±0.092周40.662 5±0.06?4周40.857 5±0.06?

*與0周比較P<0.05

3 討論

為探索自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病機(jī)制，本研究選用CBA/j小鼠，采用2次注射mTg進(jìn)行免疫的造模方法，建造自身免疫性甲狀腺炎模型。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2次加強(qiáng)后，隨著時(shí)間的增加，小鼠甲狀腺組織逐漸出現(xiàn)炎癥，并在觀測(cè)時(shí)間內(nèi)不斷加重，推測(cè)在EMT發(fā)病過程中與炎癥相關(guān)信號(hào)通路逐漸被異常激活。

TNF-α作為重要的炎癥因子，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)其在自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病過程中起重要的調(diào)控介導(dǎo)作用[10]，本研究發(fā)現(xiàn)隨著免疫時(shí)間的增加和2次加強(qiáng)免疫，小鼠血清中TNF-α含量逐漸升高，并在第2周和第4周小鼠血清中TNF-α含量顯著升高。TNF-α升高不僅導(dǎo)致炎癥部位釋放大量炎癥介質(zhì)和趨化因子，同時(shí)激活體內(nèi)的炎癥細(xì)胞，加重炎癥[11]。TNF-α的促炎作用與其激活體內(nèi)多條炎癥相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)[12]，包括NF-κB通路，大量研究發(fā)現(xiàn)在許多免疫性疾病中TNF-α激活NF-κB通路，反過來激活的NF-κB通路可啟動(dòng)TNF-α轉(zhuǎn)錄表達(dá)，形成正反饋?zhàn)饔肹13]。因此，在自身免疫性甲狀腺炎中，異常表達(dá)的TNF-α可能導(dǎo)致NF-κB通路異常激活，促進(jìn)炎癥。為此本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著免疫時(shí)間的增加和2次加強(qiáng)免疫，觀測(cè)時(shí)間內(nèi)小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量逐漸增加，與血清中TNF-α含量和甲狀腺組織中TNF-α mRNA含量變化趨勢(shì)保持同步，因此提示在甲狀腺炎的發(fā)病過程中TNF-α與NF-κB之間存在著相互促進(jìn)的正反饋機(jī)制，使炎癥加重。

NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，其激活可啟動(dòng)下游炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，在炎癥發(fā)生過程中起調(diào)控作用。其中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2以及黏附遷移相關(guān)蛋白ICAM-1基因的啟動(dòng)子中皆含有NF-κB轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別結(jié)合序列，兩者受NF-κB的激活調(diào)控[14-15]。NF-κB是否啟動(dòng)甲狀腺炎中Bcl-2和ICAM-1蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的浸潤。本研究對(duì)EMT組織中兩者的mRNA含量進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)隨著免疫時(shí)間的增加和2次加強(qiáng)免疫，觀測(cè)時(shí)間內(nèi)小鼠甲狀腺組織中Bcl-2 mRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)量逐漸增加，與甲狀腺組織中NF-κB含量變化趨勢(shì)幾乎保持同步，其中Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞增殖，加重炎癥[16]，而ICAM-1在炎癥組織中高表達(dá)可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤[17]。以上提示在EMT組織中NF-κB的異常表達(dá)可能導(dǎo)致Bcl-2 mRNA、ICAM-1 mRNA高表達(dá)，從而促進(jìn)EMT炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

NF-κB是通過IKK誘導(dǎo)IκB磷酸化所激活的。在本研究中通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著免疫時(shí)間的增加和2次加強(qiáng)免疫，觀測(cè)時(shí)間內(nèi)小鼠甲狀腺組織中IKK表達(dá)量逐漸增加，與甲狀腺組織中NF-κB含量變化趨勢(shì)幾乎保持同步，進(jìn)一步證實(shí)NF-κB途徑在EMT發(fā)病過程中被逐漸激活。

綜上所述，在EAT發(fā)病過程中，隨著初次免疫及加強(qiáng)免疫后時(shí)間在一定范圍內(nèi)增加，NF-κB通路被逐漸異常激活。其可能機(jī)制在于免疫造模促使小鼠發(fā)生針對(duì)Tg的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致血清中TNF-α含量以及甲狀腺組織中TNF-α mRNA表達(dá)量上升，進(jìn)一步使NF-κB通路與TNF-α所形成的正反饋?zhàn)饔脤?dǎo)致NF-κB通路持續(xù)激活，啟動(dòng)Bcl-2和ICAM-1基因表達(dá)，促使炎癥細(xì)胞增殖、浸潤至甲狀腺組織，導(dǎo)致炎癥。但是本研究?jī)H僅對(duì)發(fā)病過程中NF-κB通路及其炎癥因子進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測(cè)。在EAT發(fā)病過程中，所涉及通路很多，相互之間存在交叉對(duì)話，因此在后續(xù)研究中還應(yīng)該用到特異性抑制劑或激活劑進(jìn)一步探索NF-κB通路的重要性。