NLRP3在巨噬細(xì)胞抗銅綠假單胞菌感染中的作用*

鄧秋嬋， 匡文斌， 張肄鵬， 張勇剛

深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東深圳 518110)

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLR)是胞漿內(nèi)一類(lèi)重要的模式識(shí)別受體，在機(jī)體天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮獨(dú)特的功能。NLR家族中的成員，一類(lèi)可作為炎癥的調(diào)控因子；另一類(lèi)作為炎性小體的核心組分，如熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)。NLRP3炎癥小體是目前研究得最為清楚的炎癥小體，能被廣泛的刺激物所激活，激活的胱冬肽酶-1(caspase-1)調(diào)控白細(xì)胞介素(IL)-1家族細(xì)胞因子的加工及成熟。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是一種廣泛存在于環(huán)境中并容易造成機(jī)會(huì)性感染的革蘭陰性細(xì)菌，盡管有報(bào)道PA感染小鼠巨噬細(xì)胞能夠激活I(lǐng)PAF炎癥小體[1-3]，最近在膽囊纖維化患者的支氣管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PA也能夠激活NLRP3炎癥小體[4-5]，然而PA感染人的巨噬細(xì)胞炎癥小體的激活情況以及炎癥小體對(duì)PA感染引起的免疫調(diào)控并不清楚。2016年12月至2018年5月，本研究通過(guò)在THP-1巨噬細(xì)胞和人的原代巨噬細(xì)胞(hMDMs)檢測(cè)IL-1β、caspase-1和NLRP3的表達(dá)水平以及免疫熒光染色和激光共聚焦顯微成像直觀觀察NLRP3炎癥小體確定其激活情況，并通過(guò)沉默炎癥小體探討其在PA感染過(guò)程中的作用及調(diào)控機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 PA 19660購(gòu)自ATCC。尼日利亞菌素(Nig)、格列本脲(Gly)、caspase抑制劑Z-VAD-FMK購(gòu)自美國(guó)Invivogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞(TIB-202; ATCC)用佛波酯(PMA; 80 nmol/L; Sigma公司，美國(guó))誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化，誘導(dǎo)時(shí)間為16 h。PMA誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含雙抗的10% 胎牛血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶置于5% CO2，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 人外周血分離培養(yǎng) 人外周抗凝血加等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻，按1∶2比例加入淋巴細(xì)胞分離液(TBD sciences公司，中國(guó))20℃，1 800 r/min，30 min水平離心使血細(xì)胞分層。吸取中間的單核細(xì)胞層，加入1×PBS(with BSA+EDTA)，4℃，1 500 r/min，10 min離心洗滌2次，收集細(xì)胞沉淀。CD14磁珠(BD公司，美國(guó))分選出人單核細(xì)胞后用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基上加入100 ng/mL人重組細(xì)胞因子M-CSF(Peprotech 公司，美國(guó))，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行鋪板，37℃培養(yǎng)。第3天換液，7 d后，誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞備用。

1.4 ELISA 收集細(xì)胞上清，IL-1β、caspase-1和IL-18分別使用BD公司、R&D公司和eBioscience的檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每個(gè)樣本都做2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算平均值。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)目的基因 收集細(xì)胞后加入Trizol試劑(Invivogen公司，美國(guó))裂解細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行總mRNA的提取。1 μg總RNA使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，按照說(shuō)明書(shū)操作合成cDNA。合成的cDNA用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。

1.6 Western blot 各組樣品取等量的20 μg蛋白質(zhì)上樣，SDS-PAGE恒壓電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。取出硝酸纖維素膜，浸泡于含有5%脫脂奶粉的PBS中室溫封閉1 h，分別將稀釋好的一抗抗體caspase-1 抗體、NLRP3抗體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)抗體、自噬相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)抗體覆蓋于膜上，37℃孵育2 h，洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，洗滌后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)及顯影定影，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOC XR+)分析結(jié)果。

1.7 細(xì)胞RNA干擾實(shí)驗(yàn) 巨噬細(xì)胞按轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(Invivogen公司，美國(guó))的要求分別轉(zhuǎn)染siCasp1、siNLRP3、siASC以及陰性對(duì)照組siNC，siRNA從Invitrogen公司(上海)合成。其序列列表如下：siCasp1-1，5′-CCGCAAGGTTCGATTT-TCA-3′；siCasp1-2，5′-GACTCATTGAACATATGCA-3′；siNLRP3，5′-GGTGTTGGAATTAGACAAC-3′；siASC，5′-GATGCGGAAGCTCTTCAG-3′；siNC，5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.8 免疫熒光染色及共聚焦觀察 制備誘導(dǎo)分化的THP-1細(xì)胞爬片，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒及PA感染后加入4% 多聚甲醛固定，用0.05% TritonX-100室溫孵育15 min以達(dá)到穿透細(xì)胞膜的作用。加入含5% BSA的PBS室溫封閉45 min，用相應(yīng)的一抗和二抗孵育，其中用DNA熒光染料DAPI染細(xì)胞核，最后封片。用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察分析。

1.9 細(xì)菌平板計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn) 分化的THP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，PA以MOI=25感染后1 h，細(xì)胞培養(yǎng)孔板中培養(yǎng)基更換為含300 mg/mL慶大霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 min以去除胞外細(xì)菌，用0.25% 胰酶消化細(xì)胞，加入0.1% TritonX-100 冰上裂解10 min以有效裂解細(xì)胞釋放細(xì)菌。將樣品于PA分離平板涂布均勻，每個(gè)稀釋度3個(gè)平板，37℃孵箱培養(yǎng)過(guò)夜，第2天計(jì)數(shù)平板菌落。胞內(nèi)細(xì)菌殺傷通過(guò)公式[CFU(1 h)-CFU(2 h)]/CFU(1 h)×100% 換算而得。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧簇(ROS) 分化的THP-1巨噬細(xì)胞siRNA 轉(zhuǎn)染24 h后，MOI 25 PA感染或不感染細(xì)胞1 h。加入含終濃度10 μmol/L H2DCFDA的PBS重懸細(xì)胞，37℃孵育30 min染色后，收集細(xì)胞，加入預(yù)溫的完全培養(yǎng)基，37℃孵育10～20 min后用300 μL PBS重懸，立即以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)。

1.11 Griess試劑檢測(cè)NO 分化的THP-1巨噬細(xì)胞siRNA 轉(zhuǎn)染24 h后，取PA感染1、6、24 h感染后的細(xì)胞上清，按照Promega公司Griess試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在96孔板依次按要求加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品和相關(guān)試劑，每孔重復(fù)2個(gè)復(fù)孔，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)定一氧化氮(NO)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽的濃度推算出NO的含量。

2 結(jié)果

2.1 PA感染人巨噬細(xì)胞后caspase-1和IL-1β表達(dá)上調(diào) ELISA結(jié)果顯示，PA感染THP-1誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞上清中caspase-1 P20和IL-1β的分泌相對(duì)于未感染組明顯上調(diào)并呈時(shí)間和菌量依賴(lài)性(圖1-A～D)；原代人單核來(lái)源的巨噬細(xì)胞hMDMs中的ELISA結(jié)果亦顯示caspase-1 P20和IL-1β的分泌呈時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)(圖1-E、F)；而caspase-1沉默后，PA感染THP-1巨噬細(xì)胞siCasp處理組[1 h：(72.98±4.632)pg/mL、6 h：(636.9±13.91)pg/mL、24 h：(6 039±35.21)pg/mL]的IL-1β分泌相對(duì)于siNC處理組[1 h：(139.9±2.863)pg/mL、6 h：(1 370±23.33)pg/mL、24 h：(9 512±27.10)pg/mL]均顯著下降；原代hMDM細(xì)胞上清中siCasp處理組[1 h：(2.257±0.489)pg/mL、6 h：(49.76±3.427)pg/mL、24 h：(150.9±8.081)pg/mL]的IL-1β分泌相對(duì)于siNC處理組[1 h：(5.831±0.845)pg/mL；6 h：(89.88±1.881)pg/mL；24 h：(251.1±4.974)pg/mL]亦顯著下降(圖1-G、H,P<0.05)。

2.2 PA感染人巨噬細(xì)胞后NLRP3炎癥小體激活 Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，PA感染1、3和6 h后THP-1巨噬細(xì)胞中的NLRP3表達(dá)明顯上調(diào)，并隨感染時(shí)間延長(zhǎng)其mRNA(圖2-A)和蛋白水平(圖2-B)均逐漸升高。沉默NLRP3和ASC后，PA感染THP-1巨噬細(xì)胞siNLRP3處理組[1 h：(46.79±2.154)pg/mL、3 h：(55.59±7.470)pg/mL、6 h：(126.6±11.31)pg/mL]，siASC處理組[1 h：(51.72±4.133)pg/mL、3 h：(204.7±9.567)pg/mL、6 h：(365.7±6.746)pg/mL]的IL-1β分泌相對(duì)于對(duì)照組[1 h：(107.9±2.468)pg/mL、3 h：(580.8±15.92)pg/mL、6 h：(629.2±15.89)pg/mL]均顯著下降；原代hMDM細(xì)胞上清中siNLRP3處理組[1 h：(1.787±0.178)pg/mL、3 h：(33.05±6.397)pg/mL、6 h：(142.8±29.88)pg/mL]，siASC處理組[1 h：(2.757±0.781)pg/mL、3 h：(49.76±8.427)pg/mL、6 h：(150.9±31.08)pg/mL]的IL-1β分泌相對(duì)于對(duì)照組[1 h：(107.9±2.468)pg/mL、3 h：(580.8±15.92)pg/mL、6 h：(629.2±15.89)pg/mL]亦顯著下降(圖2-C、D,P<0.05)。NLRP3和caspase-1的免疫熒光染色和激光掃描共聚焦結(jié)果顯示，未感染組NLRP3和caspase-1均勻分布于胞漿中，PA感染后胞漿中出現(xiàn)明顯的NLRP3和caspase-1共定位的小體(圖2-E)，與NLRP3炎癥小體陽(yáng)性刺激劑Nig處理組相一致。

2.3 NLRP3炎癥小體抑制巨噬細(xì)胞的殺傷 細(xì)菌平板計(jì)數(shù)CFU結(jié)果顯示，沉默NLRP3炎癥小體各組后siNLRP3處理組[(77.9±1.202)%]、siASC處理組[(79.1±2.475)%]和sicaspase-1處理組[(81.8±3.041)%]巨噬細(xì)胞對(duì)PA的胞內(nèi)殺傷率相對(duì)于對(duì)照組[(59.3±0.990)%]顯著增強(qiáng)(圖3-A,分別為P<0.01、P<0.05、P<0.05)。Real-time PCR、Griess assay以及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，沉默NLRP3炎癥小體各組分與對(duì)照組相比，PA感染后防御素(BD)和殺菌性/通透性增加蛋白(Bpi)的mRNA表達(dá)水平、NO和ROS的產(chǎn)生均無(wú)明顯變化(圖3-B～D)。

2.4 NLRP3炎癥小體促進(jìn)自噬的發(fā)生 Western-blot結(jié)果顯示，沉默NLRP3炎癥小體各組分與對(duì)照組相比，LC3-Ⅱ型的蛋白水平明顯減少(圖4-A)。LC3的免疫熒光染色和激光共聚焦結(jié)果顯示，沉默NLRP3炎癥小體各組分siNLRP3處理組[(1.750±0.707)個(gè)]、siASC處理組[(1.375±0.884)個(gè)]、sicaspase-1處理組[(1.375±0.177)個(gè)]的LC3斑點(diǎn)聚集與對(duì)照組[(5.375±0.530)個(gè)]相比明顯減少(圖4-B)，并且對(duì)多個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4-C,P<0.05)。LC3和PA的共定位結(jié)果顯示，沉默NLRP3炎癥小體各組分siNLRP3處理組[(35.0±2.828)%]、siASC處理組[(32.5±3.536)%]、sicaspase-1處理組[(26.0±5.637)%]中LC3和PA的共定位與對(duì)照組[(52.5±3.536)%]相比明顯減少(圖4-D)，并且對(duì)多個(gè)視野共定位的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4-E,P<0.05)。

A：THP-1巨噬細(xì)胞在PA感染不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中caspase-1的表達(dá)水平；B：THP-1巨噬細(xì)胞在PA感染不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中IL-1β的表達(dá)水平；C：THP-1巨噬細(xì)胞在PA感染不同MOI下細(xì)胞上清中caspase-1的表達(dá)水平；D：THP-1巨噬細(xì)胞在PA感染不同MOI下細(xì)胞上清中IL-1β的表達(dá)水平；E：hMDMs在PA感染不同時(shí)間點(diǎn)下細(xì)胞上清中caspase-1的表達(dá)水平；F：hMDMs在PA感染不同時(shí)間點(diǎn)下細(xì)胞上清中IL-1β的表達(dá)水平；G：siCasp1轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞24 h，PA感染后1、6和24 h后細(xì)胞上清中IL-1β的表達(dá)；H：siCasp1轉(zhuǎn)染hMDMs 24 h，PA感染后1、6和24 h后細(xì)胞上清中IL-1β的表達(dá)；*P<0.05，**P<0.01

圖1 PA感染人巨噬細(xì)胞后caspase-1和IL-1β的表達(dá)

3 討論

作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，炎癥小體主要表達(dá)于髓樣細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和調(diào)控發(fā)揮至關(guān)重要的作用。我們?cè)谌说腡HP-1巨噬細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)NLRP3的表達(dá)水平在PA感染后顯著上調(diào)且呈時(shí)間依賴(lài)性，提示NLRP3可能參與PA的免疫應(yīng)答過(guò)程以及NLRP3炎癥小體的可能激活；進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA沉默NLRP3炎癥小體各組分，用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到IL-1β的分泌明顯下降，表明NLRP3對(duì)于PA感染誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生是必需的，在hMDMs也得到一致的結(jié)果；接下來(lái)我們通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)直觀觀察NLRP3和caspase-1的共定位確定炎癥小體的激活情況，以NLRP3炎癥小體的經(jīng)典刺激Nig作為陽(yáng)性對(duì)照。為了研究除細(xì)胞因子外的其他功能，我們通過(guò)細(xì)菌平板計(jì)數(shù)檢測(cè)沉默NLRP3炎癥小體后巨噬細(xì)胞對(duì)PA殺傷的影響；繼而通過(guò)Real-time PCR、Griess reaction、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)從抗菌肽、NO、ROS和自噬4個(gè)方面探討炎癥小體影響PA殺傷的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PA感染過(guò)程中NLRP3炎癥小體是通過(guò)調(diào)控自噬來(lái)影響PA的清除；而后分別用自噬相關(guān)蛋白7(Atg7)和自噬相關(guān)基因6(Beclin1)的siRNA抑制自噬，或用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬，通過(guò)菌落形成單位(CFU)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬對(duì)PA清除的影響，結(jié)果顯示自噬不利于巨噬細(xì)胞清除PA；最后用IL-1β重組蛋白刺激細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示IL-1β能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞對(duì)PA的胞內(nèi)殺傷。我們的研究結(jié)果表明PA感染人巨噬細(xì)胞激活了NLRP3炎癥小體，其在調(diào)節(jié)自噬和細(xì)菌清除中具有重要的作用。對(duì)于PA能夠激活I(lǐng)PAF和NLRP3炎癥小體的報(bào)道，我們認(rèn)為，NLRP3炎癥小體的刺激物非常廣泛，包括多種凝集物、結(jié)晶體、毒素以及病毒、細(xì)菌和真菌等，而IPAF炎癥小體的識(shí)別譜要窄得多，例如運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中的細(xì)菌鞭毛蛋白[6-9]。鼠傷寒沙門(mén)菌激活I(lǐng)PAF炎癥小體依賴(lài)的是細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SS運(yùn)送的鞭毛蛋白，而激活NLRP3炎癥小體不依賴(lài)于T3SS的信號(hào)，但具體機(jī)制仍不清楚[10]。我們推測(cè)，炎癥小體在宿主細(xì)胞激活的類(lèi)型很大程度上取決于細(xì)胞吞噬、產(chǎn)生和識(shí)別胞內(nèi)刺激物的能力，而這種能力和種屬特異性有關(guān)。因此，PA激活的炎癥小體類(lèi)型在我們的研究與之前研究結(jié)果不一致的原因有可能是細(xì)胞的種屬差異造成的，而我們?cè)谌思?xì)胞得到的結(jié)果似乎更有臨床參考價(jià)值。

A、B：PA感染THP-1巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)水平；C、D：THP-1巨噬細(xì)胞和hMDMs在沉默NLRP3和ASC后細(xì)胞上清中IL-1β的表達(dá)情況；E：PA感染和Nig處理THP-1巨噬細(xì)胞1 h后免疫熒光染色觀察NLRP3和caspase-1共定位的情況，DAPI(藍(lán))染細(xì)胞核，F(xiàn)ITC(綠)染NLRP3, Texas-red(紅)染caspase-1，微分干涉顯微鏡(DIC)顯示細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)；箭頭(E)所指NLRP3和caspase-1的共定位點(diǎn)(×100，比例尺=10 μm)；*P<0.05， **P<0.01

圖2 PA感染人巨噬細(xì)胞激活NLRP3炎癥小體

A：沉默NLRP3、ASC和caspase-1后用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)對(duì)巨噬細(xì)胞殺傷PA的影響；B：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)抗菌肽BD和Bpi的mRNA表達(dá)水平；C：Griess法測(cè)定NO的產(chǎn)生(如亞硝酸鹽濃度所示)； D：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PA感染1 h后ROS的水平;*P<0.05， **P<0.01

圖3 NLRP3炎癥小體抑制巨噬細(xì)胞的殺傷不依賴(lài)于抗菌肽、NO和ROS

有研究報(bào)道IPAF缺陷會(huì)導(dǎo)致PA感染小鼠的荷菌量增加但不影響小鼠的存活率[1]。然而，銅綠假單胞菌肺炎的體內(nèi)研究表明IL-1β和IL-18會(huì)減弱機(jī)體對(duì)感染肺部PA的清除能力[11-13]；亦有報(bào)道caspase-1缺陷能夠顯著減小PA角膜炎小鼠模型的眼表炎癥和角膜荷菌量[14]。而我們的體外研究表明沉默NLRP3/ASC/caspase-1能促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)PA的清除，而重組蛋白IL-1β處理會(huì)降低PA的殺傷率。這個(gè)結(jié)果提示NLRP3炎癥小體的激活有可能是PA逃逸免疫殺傷的策略，但其具體機(jī)制尚不清楚。接下來(lái)我們研究了NLRP3炎癥小體影響細(xì)菌清除的機(jī)制。結(jié)果顯示沉默NLRP3 /ASC /caspase-1不影響抗菌肽、NO和ROS的產(chǎn)生，但明顯減少巨噬細(xì)胞的自噬發(fā)生；而IL-1β蛋白處理會(huì)增加自噬反應(yīng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道caspase-1能夠通過(guò)上調(diào)Beclin1的表達(dá)促進(jìn)自噬的結(jié)果[15]是一致的?？偠灾?，以上研究提示NLRP3炎癥小體能夠通過(guò)促進(jìn)自噬從而調(diào)控巨噬細(xì)胞對(duì)PA的清除。

炎癥小體的激活導(dǎo)致細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟分泌。IL-1β和IL-18是高促炎性的細(xì)胞因子，在抗細(xì)菌、病毒和真菌感染中發(fā)揮非常重要的作用[16-17]。在革蘭陰性肺炎克雷伯菌感染的實(shí)驗(yàn)性肺炎模型中研究發(fā)現(xiàn)，促炎性細(xì)胞因子TNF和IL-1β能夠促進(jìn)肺部細(xì)菌的清除[18-19]，相反抑炎性細(xì)胞因子IL-10則削弱了宿主的防御能力[20-21]。然而，Schultz等[12-13]關(guān)于銅綠假單胞菌肺炎的研究發(fā)現(xiàn)PA誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18都是不利于肺部細(xì)菌清除的。因此，過(guò)度炎癥反應(yīng)在某些感染模型中被證明對(duì)機(jī)體是有害的[13]。Thakur等[14,22]用IL-1β和IL-18的轉(zhuǎn)化酶caspase-1抑制劑處理和ICE (caspase-1)-/-小鼠研究證實(shí)caspase-1對(duì)銅綠假單胞菌角膜炎的疾病轉(zhuǎn)歸是不利的?？梢?jiàn)，PA感染有其特異性，以上關(guān)于PA的研究很好地支持了我們對(duì)炎癥小體不利PA清除的結(jié)論。另外需要提出的是，IL-18 更多被報(bào)道的是其對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，例如IL-18有助于機(jī)體抵御肺炎鏈球菌性肺炎[23]，IL-18通過(guò)誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生增強(qiáng)宿主對(duì)銅綠假單胞菌角膜炎的抵抗能力[24]。此前，同樣是銅綠假單胞菌角膜炎的研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)高表達(dá)的IL-1β會(huì)通過(guò)促進(jìn)趨化因子MIP-2產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞的大量浸潤(rùn)從而導(dǎo)致角膜的潰瘍穿孔，是不利于病情發(fā)展的[25]。對(duì)于同一種病原體感染出現(xiàn)IL-1β和IL-18影響不同感染結(jié)局的結(jié)果在類(lèi)鼻疽伯克菌肺部感染的研究中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象[26]。因此，我們?cè)诤竺鎸?duì)于炎癥小體調(diào)控自噬和細(xì)菌清除的機(jī)制根據(jù)結(jié)果與已有的文獻(xiàn)報(bào)道選擇以IL-1β進(jìn)行解釋?？偠灾?，我們的研究有利于更好地理解PA與宿主巨噬細(xì)胞的相互作用，對(duì)尋找針對(duì)PA以及其他細(xì)菌感染的新的診斷手段和干預(yù)措施有重要意義。

A：沉默NLRP3、ASC和caspase-1后蛋白印跡法檢測(cè)LC3蛋白水平；B、C：用抗LC3抗體染色，Alexa Fluor 488結(jié)合山羊抗兔IgG(綠色)染色，共聚焦顯微鏡檢測(cè)LC3斑點(diǎn)聚集情況及計(jì)數(shù)；D、E：內(nèi)源性LC3用抗LC3抗體染色，然后用Cy3結(jié)合山羊抗兔IgG染色，共聚焦顯微鏡檢測(cè)FTGB標(biāo)記的PA(綠色)與LC3陽(yáng)性的自噬體(紅色)共定位的情況及計(jì)數(shù)；DAPI(藍(lán))染細(xì)胞核，F(xiàn)ITC(綠)染LC3(B), Texas-red(紅)染LC3(D),FTGB(綠)染PA；箭頭(D)所指LC3和PA的共定位點(diǎn)；×100，比例尺=10 μm;*P<0.05

圖4 NLRP3炎癥小體促進(jìn)自噬的發(fā)生