豬血粉酶解液脫色工藝研究

西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 重慶 402460

目前，我國(guó)年出欄生豬約7億頭，是世界上豬出欄數(shù)最多的國(guó)家，由屠宰生豬而產(chǎn)生的副產(chǎn)物豬血大約有200萬(wàn)t，資源相當(dāng)?shù)呢S富[1]。豬血的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，素有“液態(tài)肉”之稱。豬血中含有大量的蛋白質(zhì)和豐富的氨基酸，包括人體所必需的8種氨基酸在內(nèi)的18種氨基酸，特別是賴氨酸、亮氨酸含量豐富。此外，還含有適量礦物質(zhì)、維生素、激素、酶和其它一些生物活性物質(zhì)[2]。

在血液中的血細(xì)胞以紅細(xì)胞為主，紅細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量達(dá)38%，占全血蛋白總量的75%以上。紅細(xì)胞經(jīng)溶血后可得血紅蛋白，血紅蛋白再酶解成血紅蛋白多肽和氨基酸，血紅蛋白多肽比血紅蛋白具有更優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)特性、生理特性和加工特性，更容易被人體消化吸收，在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[3]。但是在酶解過(guò)程中往往伴隨大量色素物質(zhì)形成，釋放出大量血紅素，釋放的血紅素因具有疏水性而聚合成微粒，并被氧化成氧化血紅素，使生成的氨基酸和血紅蛋白多肽混合物液呈現(xiàn)出深褐色乃至黑褐色，這會(huì)干擾氨基酸、肽的分析，同時(shí)影響產(chǎn)品的純度和色澤，使其在實(shí)際應(yīng)用中受到限制[4]。因此，在制備血液制品過(guò)程中必須將色素除去。

本文以豬血粉酶解液為研究對(duì)象，主要研究了粉末活性炭用量、pH值、脫色溫度和脫色時(shí)間對(duì)豬血粉酶解液脫色效果的影響,得到了其最佳酶解工藝參數(shù)，以期為豬血多肽制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)和有益參考。

1 材料與方法

1.1 原輔料

豬血粉,天津恩彼生物工程有限公司；2709堿性蛋白酶,廣西南寧龐博生物科技有限公司20萬(wàn)u；粉末活性炭,上海生化試劑廠；氫氧化鈉、鹽酸等常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

BS200S—WE1電子天平(北京塞多利斯儀器有限公司)；H．H．S21．4電熱恒溫水浴鍋(江蘇常熟醫(yī)療器械廠)；78HW-1型恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市恒豐儀器廠)；756型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；LD-5離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)有限公司)；HB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵(寧波東勝儀器科技有限公司)；凱氏定氮裝置等。

1.3 測(cè)試指標(biāo)

1.3.1 脫色率[5]

用紫外分光光度計(jì)在色素的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值(OD)。豬血粉酶解液的最大吸收波長(zhǎng)為398nm，故選398nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

OD1—脫色前的OD398，OD2—脫色后的OD398。

1.3.2 氮損失率[6]

用凱氏定氮法測(cè)定脫色前后酶解液的含氮量。

W1—脫色前含氮量，W2—脫色后含氮量。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

豬血粉→酶解→離心→上清液→活性炭脫色→抽濾→脫色液→測(cè)定。

1.4.2 酶解

將豬血粉加水溶解，根據(jù)酶解底物濃度取樣，攪拌均勻，調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋至所需溫度，加入適量的2709堿性蛋白酶，用6mo1/L的NaOH調(diào)節(jié)酶解液至最適pH。酶解過(guò)程中用攪拌器連續(xù)攪拌，并不斷加入6mo1/L NaOH，以維持pH值的變化在規(guī)定的±0.05的范圍內(nèi)，酶解完成后，用6mo1/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5，并升溫至90℃維持20min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，以終止反應(yīng)，然后迅速冷卻至室溫，置于離心機(jī)中，在4 000r/min下離心20min，倒出上清液，記錄總體積。酶解條件：底物濃度4.0%、pH 10.5、溫度45℃、酶濃度4 000U/g、酶解時(shí)間6h[7]。

1.4.3 脫色

將離心后的上清液用粉末活性炭進(jìn)行脫色處理，即用離心機(jī)以4 000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，收集上清液。取100mL上清液，加入活性炭，調(diào)節(jié)溶液pH值，在一定的溫度下進(jìn)行脫色，脫色過(guò)程中用攪拌器不斷攪拌，讓活性炭均勻吸附。脫色完成后，用真空泵進(jìn)行抽濾，得到脫色液，分別取10mL脫色液，用蒸餾水定容到100mL，測(cè)得其吸光值。最后計(jì)算脫色率、氮損失率。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性炭用量對(duì)豬血粉酶解液脫色效果的影響

分別取100mL豬血粉酶解液于6個(gè)燒杯中，調(diào)節(jié)pH值至5.0，分別添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的活性炭于燒杯中，在50℃下脫色3h，每隔0.5h測(cè)定脫色率和氮損失率，研究活性炭用量對(duì)豬血粉酶解液脫色率和氮損失率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

由圖1和圖2可知，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，在相同溫度和pH值條件下，脫色率和氮損失率均逐漸增加；當(dāng)脫色時(shí)間相同時(shí)，隨著活性炭用量的增加，脫色率和氮損失率均逐漸升高。當(dāng)活性炭用量超過(guò)2.5%時(shí)，脫色率增幅減緩，氮損失率增大較多。因此，可初步確定活性炭用量為2.5%。

2.2 pH值對(duì)豬血粉酶解液脫色效果的影響

分別取100mL豬血粉酶解液于6個(gè)燒杯中，各添加2.5%的活性炭，分別調(diào)節(jié)pH值至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，在50℃下脫色3h，每隔0.5h測(cè)定脫色率和氮損失率，研究pH值對(duì)豬血粉酶解液脫色率和氮損失率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

從圖3和圖4可看出，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，在活性炭相同用量和相同溫度條件下，脫色率和氮損失率都逐漸增加；當(dāng)脫色時(shí)間相同時(shí)，隨著pH值的上升，脫色率和氮損失率都逐漸降低。當(dāng)pH值超過(guò)5時(shí)，脫色率下降幅度增大，同時(shí)氮損失率降低。因此，可初步確定較適pH值為5。

2.3 溫度對(duì)豬血粉酶解液脫色效果的影響

分別取100mL豬血粉酶解液于6個(gè)燒杯中，各添加2.5%的活性炭，調(diào)節(jié)pH至5.0，分別在30，40，50，60，70，80℃下脫色3h，每隔0.5h測(cè)定脫色率和氮損失率，研究溫度對(duì)豬血粉酶解液脫色率和氮損失率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

由圖5和圖6可知，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，在相同pH值和相同活性炭用量的條件下，脫色率和氮損失率都逐漸增加；當(dāng)脫色時(shí)間相同時(shí)，隨著溫度的上升，脫色率和氮損失率都逐漸升高。當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，脫色率和氮損失率增幅均減緩。因此，可初步確定較適溫度為50℃。

2.4 吸附時(shí)間對(duì)豬血粉酶解液脫色效果的影響

分別取100mL豬血粉酶解液于6個(gè)燒杯中，各添加2.5%的活性炭，調(diào)節(jié)pH至5.0，在50℃下脫色3h，每隔0.5h測(cè)定脫色率和氮損失率，研究吸附時(shí)間對(duì)豬血粉酶解液脫色率和氮損失率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。

從圖7和圖8可看出，隨著脫色溫度的上升，在活性炭相同用量和相同pH值條件下，脫色率和氮損失率都逐漸增加；當(dāng)脫色溫度相同時(shí)，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率和氮損失率均逐漸增大。當(dāng)吸附時(shí)間超過(guò)2.0h時(shí)，脫色率和氮損失率增幅變緩。因此，可初步確定吸附時(shí)間為2.0h。

2.5 豬血粉酶解液脫色工藝條件的優(yōu)化

為了得到豬血粉酶解液脫色最優(yōu)工藝條件，在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以脫色率為測(cè)試指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 因數(shù)水平表Tab.1 Factors and levels

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析表Tab. 2 The results and analysis of L9(34) orthogonal test

由表2極差分析可知，對(duì)豬血粉酶解液脫色效果影響因素由主至次依次為活性炭用量，pH值，脫色溫度，吸附時(shí)間，最優(yōu)組合為A3B1C3D2，即豬血粉酶解液脫色的最優(yōu)工藝條件為活性炭用量2.5%，pH4.0，脫色溫度60℃，吸附時(shí)間1.0h。在此最優(yōu)脫色工藝條件下，脫色率達(dá)92.20%，氮損失率為10.42%。從表3方差分析可看出，活性炭用量和pH值對(duì)豬血粉酶解液的脫色效果達(dá)到了極顯著水平，脫色溫度和吸附時(shí)間對(duì)豬血粉酶解液的脫色效果達(dá)到了顯著水平。

表3 方差分析表Tab. 3 Analysis of variance

3 結(jié)論與討論

用粉末活性炭對(duì)豬血粉酶解液進(jìn)行脫色可得到理想的脫色效果，最佳脫色工藝參數(shù)為活性炭用量2.5%，pH4.0，脫色溫度60℃，吸附時(shí)間1.0h，在此最佳脫色工藝條件下脫色率達(dá)92.20%，同時(shí)氮損失率為10.42%。

豬血粉酶解后生成低分子的肽和氨基酸，同時(shí)伴隨血紅素的形成，血紅素的存在會(huì)干擾肽的分離提純，需將其除去。粉末活性炭表面具有多孔隙結(jié)構(gòu)，比表面積大，對(duì)血紅素具有很強(qiáng)的吸附作用，并且吸附速度快，成本低，可再生[8]。

豬血粉酶解液的pH值對(duì)脫色效果有重要影響。酶解液pH值愈低，活性炭對(duì)酶解液的脫色效果愈好，這可能與構(gòu)成血紅素的卟啉化合物易溶于堿而難溶于酸的性質(zhì)有關(guān)[9]。

豬血粉酶解液溫度對(duì)脫色效果也有影響。酶解液溫度愈高，脫色效果愈好，這是由于提高溫度后分子熱運(yùn)動(dòng)加快，血紅素分子間碰撞幾率增加，有利于絮體的形成，同時(shí)也加速了活性炭對(duì)色素的吸附[10]。