不同HBV DNA載量CHB患者肝功能酶學指標、T淋巴細胞亞群、細胞因子變化及相關性

喻雪琴，戢敏，陳星，陳芳，梅怡晗，梅小平

(1川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川南充 637000；2首都醫(yī)科大學)

乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝病毒，其本身并不直接損傷肝細胞，而是在HBV誘導下發(fā)生系列免疫反應后導致肝組織損傷[1]。目前研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，宿主的免疫調節(jié)紊亂是導致HBV感染后肝組織損傷的主要原因，其HBV DNA載量與機體免疫狀況間關系如何，即HBV DNA載量與T淋巴細胞亞群水平是否具有相關性，與肝功能受損程度及炎癥細胞因子水平關系如何，不同學者的觀點存在差異。肝功能受損程度及持續(xù)時間與其預后關系密切，也是導致慢性化與肝纖維化發(fā)生的主要原因之一[4]。循環(huán)血T淋巴細胞亞群及其相應細胞因子水平是反映HBV感染后慢性乙型肝炎(CHB)患者細胞免疫狀態(tài)的關鍵指標，T淋巴細胞亞群功能、數(shù)量及相應的細胞因子比例失衡，是導致清除HBV能力障礙和肝組織炎癥持續(xù)與反復發(fā)生的原因之一[5]。為全面了解和認識不同HBV-DNA 載量的CHB患者對細胞免疫功能的影響，本研究通過檢測不同HBV DNA載量CHB患者肝功酶學指標、T淋巴細胞亞群、細胞因子，并分析各指標的相關性，以初步了解HBV DNA載量對CHB患者機體免疫狀態(tài)及肝功能受損程度的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年3月～2017年10月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院收治的CHB患者188例，男132例，女56例；年齡18～66(38.12±15.61)歲。診斷參考2015年中華醫(yī)學會肝病學分會中華醫(yī)學會感染病學分會制定的“CHB防治指南”診斷標準[6]。納入標準：①患者需知情同意；②CHB的診斷需符合中華醫(yī)學會制定的2015年版的“CHB防治指南”標準；③入院時未接受免疫調節(jié)與抗病毒治療。排除標準：①排除其他嗜肝病毒感染以及其他原因所致的肝組織炎癥者；②合并其他非嗜肝病毒感染或合并其他疾病者；③孕婦及哺乳期婦女者；④近6個月使用過抗HBV治療或激素、免疫抑制治療者；⑤CHB并肝癌者；⑥原因不明的慢型肝炎者。入組患者治療期間僅采用了恩替卡韋治療及綜合性保肝治療，在肝功能正常后僅用恩替卡韋治療。所有患者按血清HBV-DNA載量分為陰性組(<103copies/mL)35例、低拷貝組(103～<105copies/mL)55例、中拷貝組(105～<107copies/mL)56例、高拷貝組(>107copies/mL)42例，另選20例同期健康體檢者作為對照(對照組)。

1.2 肝功酶學指標、T淋巴細胞亞群、細胞因子檢測方法 收集全部入選對象清晨空腹循環(huán)靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心3 min，分離血清，并儲存于-80 ℃環(huán)境中待檢測，采用全自動生化分析儀檢測ALT、AST。抽取入選對象清晨空腹靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，采用美國BD公司流式細胞儀及相關抗體檢測外周血CD4+T、CD8+T細胞亞群百分比，計算CD4+T/CD8+T值。采用ELISA法檢測研究對象循環(huán)血TNF、IFN-γ，上述檢測由專人按照說明書操作。

2 結果

2.1 各組ALT、AST水平比較 結果見表1。

表1 各組ALT、AST水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與陰性組比較，﹟P<0.05。

2.2 各組CD4+T、CD8+T細胞比例及CD4+T/CD8+T比較 結果見表2。

表2 各組CD4+T、CD8+T細胞比例及CD4+T/CD8+T比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與陰性組比較，﹟P<0.05。

2.3 兩組循環(huán)血TNF、IFN-γ水平比較 結果見表3。

表3 兩組循環(huán)血TNF、IFN-γ水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與陰性組比較，﹟P<0.05。

2.4 CHB患者HBV DNA載量、肝功酶學指標、T淋巴細胞亞群、細胞因子的相關性 CHB患者ALT、AST水平與IFN-γ、TNF水平呈正相關(r分別為0.805、0.836、0.883、0.913，P均<0.05)，CD4+T細胞、CD8+T細胞與IFN-γ、TNF水平呈負相關(r分別為-0.797、-0.831、-0.834、-0.820，P均<0.05)。CHB患者HBV DNA載量與IFN-γ、TNF水平呈正相關(r分別為0.902、0.940，P均<0.05)，HBV DNA載量與CD4+T細胞、CD8+T細胞及CD4+T/CD8+T呈負相關(r分別為-0.820、-0.773、-0.930，P均<0.05)。

3 討論

CHB是由HBV感染持續(xù)存在而HBV不能被清除，機體長期處于免疫耐受狀態(tài)，誘發(fā)肝組織炎癥持續(xù)或反復發(fā)生所致，其發(fā)病機制可能是HBV誘導下機體免疫細胞數(shù)量及功能失衡所致，而非HBV對肝細胞直接損傷的結果[7,8]。其中T淋巴細胞群中的CD4+T細胞和誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應性的T細胞能促進B細胞、細胞毒性T細胞活化、增殖與分化[9]。HBV感染后引起肝細胞損傷的主要原因是通過CD8+T細胞包括細胞毒性T細胞和抑制性T細胞與靶細胞接觸，誘導CD8+T細胞對靶細胞殺傷作用的結果，CD8+T細胞等在HBV致敏后，釋放顆粒酶和穿孔素，損傷肝細胞，導致肝細胞的溶解與凋亡，從而發(fā)揮了對肝細胞內HBV的清除作用[10,11]。正常情況下，機體CD4+T細胞與CD8+T細胞比例穩(wěn)定在一定水平，以維持機體免疫功能穩(wěn)態(tài)，當HBV感染時，細胞毒T淋巴細胞會進行增殖分化，導致CD4+T細胞與CD8+T細胞比例失衡[4]。IFN-γ是對HBV發(fā)揮抑制作用的重要免疫調節(jié)因子，不僅通過調控機體免疫反應來抑制HBV的復制，還可通過非溶細胞原理來直接抑制HBV復制或清除HBV。TNF是單核—巨噬細胞分泌的細胞因子，具有多生物活性功能，與機體炎性反應發(fā)生關系密切[12,13]。在肝組織炎性反應發(fā)生時，Kupffer細胞釋放大量細胞因子來誘導系列級聯(lián)反應，TNF誘導、激活肝星狀細胞的活化與增殖導致膠原纖維合成、釋放與沉積，同時又對纖維蛋白溶解酶的抑制增加，導致纖維蛋白原及細胞外基質分解減少而沉積增加，進而導致肝組織纖維化、肝硬化的發(fā)生[14]。

本研究顯示，隨CHB患者循環(huán)血HBV DNA載量升高，CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比、CD4+T/CD8+T值呈顯著下降趨勢，高拷貝組CD4+T、CD8+T淋巴細胞比例、CD4+T/CD8+T值最低，表明機體HBV-DNA載量異常對患者免疫功能影響較大，HBV-DNA高載量時，機體免疫細胞耗損更明顯，肝細胞內HBV復制活動增加時，會加大對免疫系統(tǒng)刺激，長期的免疫耗損，導致機體內參加細胞免疫反應的免疫活性細胞數(shù)量減少，乙型肝炎患者炎癥更易慢性化，肝組織纖維化、肝硬化發(fā)生的風險增加，這與江若霞等[1]及何亞等[15]報道結果相一致。馬鵬[16]發(fā)現(xiàn)，與HBV-DNA陰性組比較，HBV-DNA陽性組患者CD4+T細胞百分比降低，CD8+T細胞比例升高，與健康組比較，差異有統(tǒng)計學意義，這與作者的研究結果部分一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨HBV-DNA載量增加，CD8+T細胞呈下降趨勢，與部分學者結果不一致，這可能與樣本量和患者體內細胞免疫功能紊亂程度不同所致，尚需加大樣本量來驗證。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組和陰性組比較，低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組ALT和AST水平升高；與對照組比較，陰性組AST水平降低。與對照組和陰性組比較，低拷貝組、中拷貝組、高拷貝組TNF、IFN-γ水平升高；與對照組比較，陰性組TNF水平降低、IFN-γ水平升高。提示HBV DNA載量高載量與循環(huán)血TNF、IFN-γ高表達關系密切，單核—巨噬細胞活化后會產生并釋放大量TNF參與肝組織的免疫炎性反應，TNF可抑制纖維蛋白溶解酶活性，導致肝組織炎癥與纖維化的發(fā)生，可能是CHB患者炎癥慢性化的因素之一[17,18]。作者認為，HBV DNA載量增加會加大對機體免疫系統(tǒng)刺激，T細胞等免疫細胞激活后，合成并釋放大量IFN-γ從而增加機體對病毒的清除作用。但李曼等[19]發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者外周血IFN-γ表達水平與HBV DNA載量呈反比，其結果差異可能與HBV DNA清除過程中肝功能受損程度、機體所處的免疫狀態(tài)不同有關。

本研究還顯示，CHB患者ALT、AST水平與TNF、IFN-γ表達水平呈正相關，CD4+T/CD8+T與TNF、IFN-γ呈負相關，顯示TNF、IFN-γ水平與肝組織炎癥反應程度密切相關。CD4+T、CD8+T比例與TNF、IFN-γ呈負相關，提示當T淋巴細胞介導的溶細胞性清除HBV能力降低，HBV不能有效清除時，機體會調控增加IFN-γ的表達水平，從而增強機體非溶細胞性病毒清除反應，此過程也會使肝組織的炎性反應增強，加重肝組織損傷。本研究還顯示，CHB患者TNF、IFN-γ水平與HBV DNA載量呈正相關，T淋巴細胞水平與HBV DNA載量呈負相關，提示循環(huán)血中TNF、IFN-γ高表達與CHB患者體內HBV復制程度密切相關，HBV作為外來抗原，介導系列信號途徑刺激免疫細胞活化并釋放相應細胞因子參與肝組織免疫炎性反應，同時CHB患者CD4+T細胞水平下調，導致機體特異性抗體生成不足，HBV不能被清除而在機體內持續(xù)表達，CD4+T/CD8+T值是檢測機體免疫功能及免疫穩(wěn)態(tài)的重要指標，其比例失衡可導致肝臟一系列免疫病理改變，這與姚瑋等[5,20]研究結果一致。

總之，隨著HBV DNA載量的增加，CHB患者T淋巴細胞亞群百分比逐漸下降，肝功酶學指標及細胞因子逐漸升高；CHB患者ALT、AST水平與IFN-γ、TNF水平呈正相關，CD4+T、CD8+T比例與IFN-γ、TNF水平呈負相關；HBV DNA載量與IFN-γ、TNF水平呈正相關，與CD4+T、CD8+T比例及CD4+T/CD8+T呈負相關。