miRNA-299-3p對肺癌細胞系A549遷移、增殖、凋亡、多柔比星敏感性的影響

汪洋，汪群，張峰

(湖北省腫瘤醫(yī)院，武漢 430079)

肺癌是發(fā)病率與病死率較高的惡性腫瘤疾病，尤其對于男性患者，其發(fā)病率與病死率在各種惡性腫瘤中高居首位，且臨床預后效果差[1～3]。化療是臨床上治療肺癌的重要手段，其在改善手術患者預后、延長患者生存期等方面發(fā)揮重要作用。然而臨床數(shù)據(jù)顯示，不同肺癌患者對化療的敏感性有明顯差異，且不少患者在化療過程中逐漸出現(xiàn)藥物敏感性降低的現(xiàn)象，嚴重影響化療效果[4,5]。近年研究[6]發(fā)現(xiàn)，許多對化療藥物出現(xiàn)耐受現(xiàn)象的肺癌患者同時伴隨三磷酸腺苷結合盒E1(ABCE1)基因表達的上調，而抑制ABCE1基因的表達顯著增加了多種肺癌細胞株對多柔比星的敏感性，為ABCE1作為肺癌耐藥相關基因提供了直接證據(jù)，同時也表明ABCE1有望作為提高肺癌細胞化療敏感性的基因靶點。 微小RNA(miRNA)對基因表達的調控非常重要，通常修飾成21～23個堿基長的短非編碼核苷酸序列，通過與miR的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)中的部分互補序列雜交來調節(jié)靶基因表達，并阻斷翻譯或導致miR的降解[7～9]。miR-299-3p是一種具有重要調控功能的mRNA，其在惡性間皮瘤細胞中有差異表達[10]。文獻[11]報道，miR-299-3p在人類干細胞中表達上調。此外，miR-299-3p已被描述為人臍靜脈內皮細胞中復制衰老的重要因子[12]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，ABCE1是miR-299-3p分子的下游重要靶基因之一，miR-299-3p的上調將顯著抑制ABCE1基因的表達。本研究觀察了miR-299-3p對人肺癌細胞A459遷移、增殖、凋亡、多柔比星化療敏感性等生物行為的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細胞株購自美國ATCC細胞庫；多柔比星、鹽酸多柔比星購自美國Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Tunnel凋亡檢測試劑盒購自中國凱基生物技術有限公司；ABCE1抗體、p-Akt抗體、Akt抗體、Caspase3抗體均購自美國Abcam公司；抗人GAPDH以及辣根酶標記二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；細胞培養(yǎng)孵箱購自美國Thermo公司；miRNA由Invitrogen公司合成；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和miR-299-3p細胞轉染 取A549細胞放入RPMI1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，另添加100 U/mL青霉素與100 mg/L鏈霉素，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。細胞生長至90%以上匯合后，使用0.25%胰酶消化收集細胞，以1∶3比例進行傳代擴增。A549細胞以1×105細胞/孔的密度接種于24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞匯合至90%以上時分為正常A549細胞組(對照組)、miR-299-3p轉染組(miR-299-3p組)和隨機序列轉染的A549細胞組(隨機miRNA組)，miR-299-3p序列分子以及對照的隨機序列分子的轉染使用LipofectamineTM2000轉染試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明書進行操作。

1.3 細胞ABCE1蛋白檢測 采用Western blotting法。轉染48 h后，分別收集“1.2中”各組1×107個細胞，PBS沖洗3次，隨后加入細胞裂解液處理細胞，并使用超聲儀處理輔助破碎細胞，離心去除細胞碎片后收集上清，提取總蛋白，在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉移4 h到PVDF膜上，然后37 ℃封閉2 h后加入ABCE1一抗，與膜孵育1 h，然后洗膜，加入辣根酶標記二抗，37 ℃孵育2 h，PBB洗滌，最后ECL試劑盒進行化學發(fā)光檢測，壓片、顯影、定影，采用Image-Pro Plus7.0軟件分析條帶灰度值。每個實驗重復3次，取平均值。

1.4 細胞遷移能力觀察 將“1.2中”miR-299-3p組和對照組A549細胞接種于6孔板，細胞生長至匯合后，使用200 μL移液槍頭對細胞層進行劃痕，并標記劃痕位點，顯微鏡下進行拍照；2 d后，顯微鏡下對同一劃痕微點再次進行拍照觀察，評價腫瘤細胞向劃痕區(qū)的遷移情況。

1.5 細胞增殖能力及多柔比星敏感性觀察 取“1.2中”miR-299-3p組和對照組A549細胞，以5×103每孔接種于96孔培養(yǎng)版，每孔100 μL培養(yǎng)基，每天進行1次CCK-8檢測，共檢測6 d，基本方法是向每孔細胞中加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)在孵箱中孵育1.5 h，隨后在450 nm波長處使用酶標儀檢測OD值。此外取“1.2中”miR-299-3p組和對照組A549細胞，經(jīng)不同濃度(0、0.1、1、10、50 μg/mL)多柔比星處理，采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖活性(OD值)。

1.6 各組細胞Csp3、p-Akt蛋白檢測 取A549細胞，隨機分為4組，miR-299-3p轉染組以miR-299-3p轉染A549細胞，多柔比星組加入50 μg/mL單純多柔比星，聯(lián)合組以miR-299-3p轉染A549細胞并加入50 μg/mL多柔比星，對照組細胞不做任何處理。胰酶消化收集各組細胞1×107個細胞，PBS沖洗3次，隨后加入細胞裂解液處理，并使用超聲儀處理輔助破碎細胞，離心去除細胞碎片后收集上清，通過BCA法測定蛋白濃度。通過凝膠電泳對蛋白進行檢測，每個泳道上樣量為80 μg；電泳結束后以100 V恒壓電轉4 h，將蛋白轉移PVDF膜，37 ℃封閉2 h，后加入p-Akt抗體、Akt抗體、Caspase3抗體一抗，與膜孵育1 h，然后洗膜，加入辣根酶標記二抗，37 ℃孵育2 h，PBB洗滌，最后化學發(fā)光顯色試劑盒進行檢測，壓片、顯影、定影，以GAPDH蛋白條帶標準化目的蛋白條帶，目標蛋白條帶的定量是使用Image-Pro Plus7.0分析軟件對條帶的灰度值進行測定，實驗重復3次，取平均值。

1.7 各組細胞凋亡能力觀察 通過末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)檢測細胞凋亡，操作步驟按照廠家說明書進行。染色后的細胞通過4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標記細胞核，在熒光顯微鏡下觀察TUNEL標記的陽性細胞比例，并計數(shù)，細胞凋亡比例=TUNEL陽性細胞數(shù)/DAPI染色細胞數(shù)。

2 結果

2.1 各組ABCE1蛋白表達比較 miR-299-3p組、隨機miRNA組、對照組ABCE1蛋白相對表達量分別為0.46±0.11、1.17±0.20、1.04±0.17，miR-299-3p組分別與隨機miRNA組、對照組比較，P均<0.05。

2.2 各組細胞遷移能力比較 實驗2 d后，miR-299-3p組、對照組細胞劃痕區(qū)域寬度分別為415.34±57.42、422.45±60.31，兩組細胞劃痕區(qū)域寬度未觀察到明顯差異(詳見圖1)。

圖1 兩組細胞劃痕區(qū)域寬度比較

2.3 兩組各時點細胞增殖能力比較 結果見表1。由表1可知，兩組各時點細胞OD值比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。

表1 兩組各時點細胞增殖能力比較

2.4 兩組細胞多柔比星敏感性比較 結果見表2。

2.5 各組細胞Csp3、p-Akt蛋白表達比較 結果見表3。

表2 兩組細胞多柔比星敏感性比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

表3 各組細胞Csp3、p-Akt蛋白表達比較

注：與miR-299-3p組比較，*P<0.05；與多柔比星組比較，ΔP<0.05。

2.6 各組細胞凋亡能力比較 聯(lián)合組、多柔比星組、miR-299-3p組、對照組凋亡細胞數(shù)分別為33.76%±5.73%、17.35%±5.21%、4.33%±1.93%、3.10%±2.12%，聯(lián)合組、多柔比星組分別與miR-299-3p組、對照組比較，P均<0.05。

3 討論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，是全世界癌癥死亡的主要原因，每年導致超過100萬人死亡[13]。根據(jù)臨床病理特征，主要肺癌分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)兩種組織學亞型。SCLC對放療和化療均具有高度敏感的反應，但是耐藥性導致高復發(fā)率和不良預后。一般來說，SCLC患者最終確診后2年生存率低于5%[14]。多柔比星是一種蒽環(huán)類藥物，廣泛用于化療方案治療SCLC患者。但目前化學耐藥已成為SCLC治療的主要障礙之一，是改善SCLC臨床預后不良的重要問題。為了提高化療效果，增加給藥劑量是最直接的治療方式，但這一策略在提高化療效果的同時，也增加了對正常機體細胞的負效應，可行性受到很大限制。因此，在不改變藥物劑量的條件下，提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，對于改善化療效果具有重要意義。A549細胞最早是在1972年由Giard等通過一個白人成年男性的外植體腫瘤，轉移并培養(yǎng)肺腫瘤組織而得到的。由于A549細胞體外培養(yǎng)會成長為單層細胞，附著或緊貼在培養(yǎng)瓶上，也可以固定或懸掛在體外的溶液中。因此，研究者多采用A549細胞作為研究對象。

研究發(fā)現(xiàn)，一些miR的表達與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關，其中腫瘤相關疾病是其研究最熱的領域之一，涉及腫瘤增殖、遷移、凋亡、藥物耐受等多個領域。一般而言，一個miR分子可能存在多個靶基因，一個基因也可能同時受到多個miR分子的調控[15]。以往報道證實，ABCE1是肺癌耐藥相關基因，靶向抑制ABCE1的miR-299-3p能夠顯著提高肺癌細胞A549對多柔比星的敏感性，有望發(fā)展成為協(xié)同多柔比星抑制肺癌以及克服藥物耐受肺癌的聯(lián)合基因療法[16]。ABCE1是以往已被證實的一個肺癌相關耐藥基因，也是miR-299-3p的靶基因之一。本研究也進一步證實了miR-299-3p對ABCE1基因具有靶向抑制作用。盡管miR-299-3p已被鑒定出來，但其生物學功能仍然知之甚少。研究[17]發(fā)現(xiàn)，miR-299-3p在白血病中顯著下調。之前的研究[18]表明，miR-299-3p在骨肉瘤組織中表達下調，并證明其與化療有關。最近一項研究[19]報道，miR-299-3p的失調與肺癌中的阿霉素耐藥有關。然而，miR-299-3p在肺癌阿霉素耐藥中的確切作用尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素耐藥肺癌組織中miR-299-3p表達下降幅度大于阿霉素敏感性肺癌組織。文獻報道，miR-299-3p在H69/ADR細胞中顯著降低，miR-299-3p的過表達顯著抑制H69/ADR肺癌細胞增殖，增加細胞凋亡。miR-299-3p在H69/ADR肺癌細胞增殖和細胞凋亡中起關鍵作用[15]。本研究通過劃痕實驗證實，miR-299-3p轉染的A549細胞并不影響其遷移能力。細胞增殖活性檢測發(fā)現(xiàn)，miR-299-3p對靶基因ABCE1的抑制作用并不影響A549細胞的增殖能力。進一步了解miR-299-3p轉染是否影響了A549細胞對多柔比星的敏感性，結果表明miR-299-3p轉染顯著增加了A549細胞對多柔比星的敏感性。Csp-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用，Csp-3通過調控細胞內某種酶可裂解核小體間的DNA，引起細胞凋亡。Akt又稱為蛋白激酶B，是細胞內信號轉導通路上的一種原癌基因，磷脂酰肌醇3-激酶使Akt活化后生成p-Akt，可直接或間接調控細胞凋亡，發(fā)揮促進腫瘤細胞生存作用。本研究表明，miR-299-3p聯(lián)合多柔比星處理的A549細胞中Csp3水平顯著較高，p-Akt水平顯著降低，其凋亡細胞顯著增多，顯著的優(yōu)于單獨多柔比星組和miR-299-3p組。說明miR-299-3p聯(lián)合多柔比星可顯著促進腫瘤細胞的凋亡。

總之，miR-299-3p靶向抑制耐藥基因ABCE1的表達，其過表達并不能顯著抑制A549細胞的增殖，但miR-299-3p聯(lián)合多柔比星可促進了肺癌A549細胞對多柔比星的敏感性，顯著促進了A439細胞的凋亡，有望作為一種協(xié)同化療的核酸藥物。