miR-639在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其模擬物轉(zhuǎn)染對人骨肉瘤細(xì)胞U20S增殖、遷移、侵襲能力的影響

張瓊，張琳，楊臻，陳楠

( 1天津市兒童醫(yī)院，天津 300074；2天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院)

骨肉瘤來源于原始成骨間充質(zhì)細(xì)胞，是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤[1]。骨肉瘤常發(fā)生于脛骨近端、肱骨、股骨遠(yuǎn)端的干骺部，典型癥狀包括局部腫脹、關(guān)節(jié)活動受限、疼痛以及小梁骨受損[2,3]。骨肉瘤不僅惡性程度高，轉(zhuǎn)發(fā)和轉(zhuǎn)移率也很高[4]。骨肉瘤的年齡分布主要集中在10～20歲青少年和老年人群，呈現(xiàn)雙高峰分布狀態(tài)[5]。目前，對于骨肉瘤的治療主要包括手術(shù)切除聯(lián)合放化療[6]。雖然某些臨床研究提供了相關(guān)的手段進(jìn)行診斷和治療，但效果仍不盡如人意，預(yù)后效果也較差，骨肉瘤患者的五年生存率僅為60%～70%，轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的臨床預(yù)后效果更差[7]。因此，探索一種新的特異性的骨肉瘤診療標(biāo)志物是目前的重中之重。研究[8～10]表明，微小RNA(miRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中通過調(diào)控不同的生物過程而發(fā)揮重要的作用，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝以及轉(zhuǎn)移等。文獻(xiàn)[11,12]報(bào)道，miR-639在甲狀腺癌和乳腺癌中起促癌基因的作用。但是，miR-639在骨肉瘤中的研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察了miR-639在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，另觀察了miR-639模擬物(miR-639 mimics)轉(zhuǎn)染對人骨肉瘤細(xì)胞U20S增殖、遷移、侵襲能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及miR-639模擬物 U20S細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清均購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑TRIzol、蛋白裂解液RIPA、Lipofetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix EX TaqTM ⅡPCR Kit均購自日本Takara 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒Cell Counting Kit-8、EdU試劑盒均購自Sigma公司；Transwell小室購自美國密理博Millipore公司；抗TUSC5單克隆抗體、抗GAPDH多克隆抗體均購自Abcam公司；miR-639 mimics及模擬物陰性對照(miR-NC)合成于上海吉瑪基因公司。

1.2 骨肉瘤、癌旁組織miR-639分析 直接提取NCBI-GEO和TCGA公共數(shù)據(jù)庫中的測序數(shù)據(jù)，并采用GraphPad軟件作圖，根據(jù)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)資料分析骨肉瘤、癌旁組織miR-639的相對表達(dá)量。

1.3 U20S細(xì)胞培養(yǎng)、分組及miR-639 mimics轉(zhuǎn)染 取U20S細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，取生長情況良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞板，細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，采用Lipofectamine2000進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，按照按試劑說明書，將miR-639 mimics和miR-NC轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)20S細(xì)胞中(分別計(jì)為觀察組和對照組)，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 U20S細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力觀察 ①細(xì)胞增殖能力：1.克隆形成實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，取5×102個細(xì)胞接種于12孔板中，在37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液。14 d后用結(jié)晶紫染液染色10 min，用輕緩的水流將結(jié)晶紫沖洗干凈。用成像系統(tǒng)拍照后，計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(個)。2.EdU增殖實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，取5×104個細(xì)胞接種于12孔板中，在37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照廣州銳博生物公司提供的試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)。拍照后，計(jì)數(shù)被染成紅色的細(xì)胞數(shù)(個)。②細(xì)胞遷移能力：采用Transwell遷移細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。胰酶消化細(xì)胞后用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為30×104/mL，取200 μL加在小室上層，取800 μL含20%血清的DMEM加入小室下層，置于37 ℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后取出小室，PBS清洗兩遍，每孔加入固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)1 mL，固定30 min，棉簽擦除小室內(nèi)未穿過的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色10 min，清水沖洗后棉簽擦除小室內(nèi)殘余的結(jié)晶紫，用中性樹脂固定于載玻片上。倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個不重復(fù)的視野拍照并計(jì)數(shù)穿膜到下室面的細(xì)胞數(shù)(個)。③細(xì)胞侵襲能力：采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。提前4 h向用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的小室中加入45 μL的Matrigel膠，并置于37 ℃孵箱凝膠。胰酶消化細(xì)胞后用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為30×104/mL，取200 μL加在小室上層，取800 μL含20%血清的DMEM加入小室下層，置于37 ℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后取出小室，PBS清洗兩遍，每孔加入固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)1 mL，固定30 min，棉簽擦除小室內(nèi)未穿過的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色10 min，清水沖洗后棉簽擦除小室內(nèi)殘余的結(jié)晶紫，用中性樹脂固定于載玻片上。倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個不重復(fù)的視野拍照并計(jì)數(shù)穿膜到下室面的細(xì)胞數(shù)(個)。

1.5 U20S細(xì)胞TUSC5 mRNA、蛋白檢測 ①TUSC5 mRNA：采用熒光定量PCR法。對轉(zhuǎn)染48 h后的貼壁U20S細(xì)胞依照TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。提取RNA后遵照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，剩余的RNA存于-80 ℃?zhèn)溆?。紫外分光光度?jì)鑒定總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求，取100 ng總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。配置PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)，反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)。TUSC5引物序列： 上游引物5′GCACAGACTCAAAGGGAAACC3′，下游引物5′ACCTAAGCAGCACCAGACG3′；GAPDH引物序列：上游引物5′GACTTCAACAGCGACACCC 3′；下游引物5′AGGTGCGGCTCCCTAGGCCCCTCCC3′。以GAPDH作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt代表TUSC5相對表達(dá)水平。②TUSC5蛋白：采用Western blotting法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。取約30 μg蛋白進(jìn)行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，TUSC5抗體和GAPDH抗體以1∶2 000比例進(jìn)行孵育，4 ℃過夜。TBST洗膜4次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜4次，每次5 min，ECL發(fā)光法顯影曝光。以GAPDH作為對照，條帶灰度值采用Quality One分析。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤、癌旁組織中miR-639表達(dá)比較 GEO數(shù)據(jù)庫顯示，骨肉瘤、癌旁組織中miR-639表達(dá)水平分別為11.2±0.4、7.1±0.6，兩者比較，P<0.05；TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，骨肉瘤、癌旁組織中miR-639表達(dá)水平分別為19.5±3.4、7.7±2.2，兩者比較，P<0.05。

2.2 miR-639高表達(dá)與骨肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 由表1可知，miR-639高表達(dá)與骨肉瘤腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、解剖部位有關(guān)(P均<0.05)。

表1 miR-639高表達(dá)與骨肉瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 兩組細(xì)胞增殖能力比較 觀察組、對照組集落形成數(shù)分別為(155±12)、(84±8)個，兩組比較，P<0.05；EdU染色細(xì)胞數(shù)分別為(14±3)、(6±2)個，兩組比較，P均<0.05。

2.4 兩組遷移細(xì)胞、侵襲能力比較 觀察組和對照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(120±30)、(70±18)個，兩組比較，P<0.05；觀察組和對照組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(100±16)、(52±23)個，兩組比較，P均<0.05。

2.5 兩組TUSC5 mRNA、蛋白表達(dá)比較 觀察組和對照組TUSC5 mRNA分別為0.18±0.07、0.84±0.13，TUSC5蛋白分別為0.31±0.06、0.81±0.09，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，主要影響兒童和年輕人，特征是與骨質(zhì)溶解相關(guān)的骨樣新生成，主要發(fā)生在長骨的干骺端[13,14]。目前，骨肉瘤的治療方法通?；谑中g(shù)和化療的結(jié)合，5年生存率為60%～70%，但患者的化療抵抗和局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移擴(kuò)散非常普遍[15]。目前，臨床上藥物的毒性閾值和肺轉(zhuǎn)移的存在是治愈骨肉瘤的兩個主要障礙[16]。盡管科學(xué)家們一直進(jìn)行治療優(yōu)化的努力，轉(zhuǎn)移性的擴(kuò)散仍然極大地?fù)p害了癌癥患者的生存，因此需要更好地理解其發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制。

miRNAs通過調(diào)控多個靶基因的表達(dá)發(fā)揮生物功能，以往對于miR-639靶基因的研究較少。最新研究[17,18]表明，miR-639可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，另外miR-639可以在前列腺癌中作為一種新的分子標(biāo)志物。本研究顯示，miR-639在骨肉瘤中高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，由于樣本量較小，相關(guān)性不是很顯著，今后可以擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行深度分析。已有研究表明，miR-639可以顯著促進(jìn)甲狀腺癌和乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，因此我們研究分析了miR-639對U20S細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。CCK8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)以及EdU嵌合實(shí)驗(yàn)證明，miR-639可以顯著促進(jìn)U20S細(xì)胞的增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)證明miR-639可以顯著促進(jìn)U20S細(xì)胞的遷移和侵襲能力。提示miR-639可能是骨髓瘤治療的重要靶點(diǎn)。miRNA一般是通過調(diào)控靶基因表達(dá)發(fā)揮作用，因此本研究通過軟件對miR-639新的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，我們首先miR-639可以靶向調(diào)控TUSC5基因，通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNAs靶基因的結(jié)果可能存在假陽性。因此，我們進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-639可以抑制TUSC5的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，證明miR-639在轉(zhuǎn)錄水平上對TUSC5確實(shí)具有調(diào)控作用。

TUSC5基因是最新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在乳腺癌中低表達(dá)，是乳腺癌不良預(yù)后的新的生物標(biāo)志物，另外MiR-3188可以靶向TUSC5調(diào)控乳腺癌的增殖、遷移和凋亡[19,20]。本研究顯示，觀察組TUSC5 mRNA和蛋白低于對照組。因此我們推測，miR-639也可能通過抑制TUSC5基因?qū)撬枇黾?xì)胞的凋亡發(fā)揮重要調(diào)控作用，下一步需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

總之，miR-639在骨肉瘤組織中表達(dá)升高；miR-639 mimics促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，可能與抑制TUSC5有關(guān)。