脊肌萎縮癥治療研究進展

呂亞豐 張艷君 程謨斌 劉子瑾 董文吉 張 業(yè)

脊肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)是一種單基因常染色體隱性遺傳疾病，主要是由于SMN1基因的純合子缺失而導致，其特征是脊髓前角細胞變性和由此引起的肌肉萎縮和無力，該疾病發(fā)生率為1/6000～10000，攜帶率為1/40～50，是導致嬰兒死亡的最主要遺傳病。SMA的治療主要分為優(yōu)化臨床管理和藥物治療兩個方面，但目前沒有藥物能夠有效治療SMA，盡管如此，在過去20多年累積的對SMA分子遺傳學和病理生理學的認識，為藥物的研發(fā)奠定了堅實的理論基礎，也為迎來轉(zhuǎn)化醫(yī)學的新時代做好了準備。

一、脊肌萎縮癥發(fā)病的分子機制

該疾病由Werdnig于1891年首次報道[1]。1995年Melki 實驗室克隆并鑒定該病的致病基因為運動神經(jīng)元存活基因1(survival motor neuron 1，SMN1)[2]，人類SMN基因位于5q13，分為SMN1和SMN2，SMN1基因位于端粒側(cè)，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生全長mRNA，編碼全長為294個氨基酸的SMN蛋白質(zhì)，SMN2基因位于著絲粒側(cè)，SMN2基因與SMN1基因在外顯剪接增強子處有一個核苷酸的差異，從而使得轉(zhuǎn)錄后的SMN2缺失第7個外顯子，編碼截斷的SMN蛋白，截斷的SMN蛋白喪失全長SMN蛋白的功能，并且在細胞內(nèi)迅速降解。有趣的是，SMN2 mRNA的第7個外顯子在有些情況下并不是全部缺失，SMN2基因仍然能夠產(chǎn)生一小部分(10%～15%)全長mRNA，這部分mRNA可編碼具有正常功能的SMN蛋白(圖1)。

研究發(fā)現(xiàn)95%的SMA是由于SMN1基因的純合子缺失而引起，SMA患者體內(nèi)由于SMN1基因的缺失，不能產(chǎn)生足夠的SMN蛋白。在疾病狀態(tài)下，體內(nèi)SMN蛋白主要來源于SMN2基因，由于SMN2基因只有少部分可產(chǎn)生功能性SMN蛋白，因此SMA主要是由于體內(nèi)SMN蛋白的缺乏而引起。SMA患者中SMN2基因的拷貝數(shù)差異較大，表型分析發(fā)現(xiàn)一般情況下SMN2基因的拷貝數(shù)與疾病的嚴重程度呈負相關[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，雖然SMN2基因的拷貝數(shù)是SMA疾病嚴重程度的最主要決定因素，但不是唯一因素。Prior 等[4]在3例3型SMA患者中發(fā)現(xiàn)其SMN2僅有2個拷貝，這些患者SMN2基因的第7個外顯子有一個核苷酸的突變，即c.859G>C，突變后形成一個外顯剪接增強子元件，從而產(chǎn)生了更多的全長SMN蛋白及較輕的臨床表現(xiàn)。因此需要注意的是SMA的表型也不能完全由SMN2基因的拷貝數(shù)來推斷(圖1)。

二、脊肌萎縮癥的分類及臨床表現(xiàn)

根據(jù)患者的發(fā)病年齡和疾病的嚴重程度，脊肌萎縮癥分為5種亞型：①0型患者：一般多見于胎兒或新生兒，胎兒表現(xiàn)為胎動減少，新生兒表現(xiàn)為肌肉反射消失、面部癱瘓、房間隔缺損和關節(jié)攣縮，最嚴重的表現(xiàn)為呼吸衰竭，病兒預期壽命大大縮短，大多數(shù)生存期在6個月以內(nèi)[5]；②1型患者：即嬰兒型，也稱為Werdnig-Hoffman病，患者出生后6個月內(nèi)出現(xiàn)肌張力低下，頭部控制不佳和肌腱反射減弱或消失。嚴重的肌張力低下，表現(xiàn)為躺倒時的“蛙腿”姿勢，缺乏頭部控制，不能端坐，肋間肌肉薄弱，膈肌相對較小，患者往往出現(xiàn)吞咽功能減弱，由于呼吸肌無力，SMA患兒通常在2歲前出現(xiàn)呼吸衰竭[6]；③2型患者：即中間型，一般在出生后6～18個月內(nèi)發(fā)病，患者可以在發(fā)育過程中的某一階段獨坐，但無法獨立行走。該類患者多出現(xiàn)脊柱側(cè)凸、關節(jié)攣縮和下頜關節(jié)強直等并發(fā)癥，脊柱側(cè)凸和肋間肌無力往往導致嚴重的肺部疾病。這些兒童的認知能力是正常的[7]；④3型患者：即少年型，也稱為Kugelberg-Welander病，患者一般在出生后18個月～5歲內(nèi)發(fā)病，在輔助物支撐的幫助下可行走。與2型SMA 不同的是，這些人大多沒有脊柱側(cè)彎和呼吸肌無力等并發(fā)癥，這個群體的認知和預期壽命一般不受疾病的影響[8]；⑤4型患者：在少年之后發(fā)病的歸分類為4型SMA，它們大約占SMA患者總數(shù)的5%，僅有輕微的癥狀。與3型相似，但是發(fā)病在成年期，通常認為在30歲或更晚時候發(fā)病[9]。

圖1 SMN1基因與SMN2基因pre-mRNA的剪接

三、脊肌萎縮癥的治療

從SMA的首次報道至今已經(jīng)有100多年的歷史。在20世紀90年代之前，因為沒有明確的分子靶標，SMA的臨床試驗相對較少，所進行的研究通常涉及用于改善疾病癥狀的藥物，相關研究在以肌無力為特征的其他疾病如肌萎縮側(cè)索硬化癥或肌營養(yǎng)不良癥中表現(xiàn)出令人鼓舞的結(jié)果。SMA的遺傳和分子基礎的闡明為基于增加SMN蛋白表達以治療SMA的策略提供了理論基礎。這些策略包括利用低分子藥物或反義核苷酸藥物增加SMN2表達(導致更多全長SMN mRNA)，以及病毒載體介導的替代全長SMN1的基因療法。目前有些藥物已經(jīng)上市，有的藥物正在進行臨床試驗，基于重組相關病毒載體的基因治療藥物已初露端倪。

1.低分子藥物：目前，全球正在開發(fā)多種通過不同機制增加全長SMN蛋白水平的低分子藥物。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿┍交∷徕c、丙戊酸和羥基尿等可以增加SMN2 mRNA水平，并且在SMA小鼠模型和細胞系中顯示出良好的結(jié)果，但是臨床試驗顯示很少或沒有療效。其他低分子藥物如氨基糖苷類，主要通過抑制SMN2基因SMNΔ7外顯子8的終止密碼子的識別，而將截短的SMN蛋白質(zhì)延長，顯著增加SMN蛋白在SMA患者成纖維細胞中的表達，皮下注射該化合物(TC007)后，雖然沒有延長小鼠生存期，但增強了SMA轉(zhuǎn)基因小鼠的運動功能[10]。除此之外，還在開發(fā)一類更有效的能夠改變SMN2轉(zhuǎn)錄物剪接模式的藥物，使得更有利于包含外顯子7， 這些藥物在SMA小鼠模型上具有非常顯著的功效，目前正在進行臨床試驗。RG7800是美國PTC Therapeutics公司使用高通量藥物篩選平臺篩選到的一種低分子藥物[11]。羅氏公司對該化合物進行了化學優(yōu)化，并將其作為口服生物藥物進入臨床，2015年開展了1期多中心隨機、雙盲、安慰劑對照研究，以研究成人和兒童SMA患者對RG7800治療12周后的安全性、耐受性、藥代動力學和藥效學。在招募第1批患者后，由于在臨床前毒理學研究中觀察到影響眼睛的安全性問題，研究人員終止了臨床試驗。最近，羅氏公司開展了兩項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，旨在研究化合物RG7916對1型、2型和3型SMA患者的安全性、耐受性、藥代動力學、藥效學和療效，這兩項研究目前正在進行。諾華公司正在尋求一種類似的策略，該策略也能夠增加SMN2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中外顯子7的保留，并且能夠顯著提高SMA小鼠模型的預期壽命[12]。2015年4月在4個歐洲國家啟動了1型SMA患者Ⅰ/Ⅱ期口服LMI070(NCT02268552)臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對周圍神經(jīng)、脊髓、睪丸和腎臟血管具有不良反應，在2016年中期，決定暫停招募患者，并將其作為平行的慢性臨床前毒理學研究，此試驗自宣布以來，所有參加試驗的患者都得到密切監(jiān)測，研究還在進行，但不再招募患者。

2.反義寡核苷酸藥物：通過改變SMN2剪接方式，使更多外顯子7包含到最終的mRNA轉(zhuǎn)錄物中，并且增加全長SMN蛋白的表達是治療SMA的一種有希望的策略。這種策略的原理是通過設計一種能靶向SMN2前體mRNA的內(nèi)含子或外顯子中順式作用序列的藥物，從而通過影響各種反式剪接因子來調(diào)節(jié)SMN2前體mRNA的剪接。

反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)是治療性RNA分子，通過靶向結(jié)合內(nèi)含子或外顯子內(nèi)的互補序列，從而增強或破壞剪接事件。最初的ASO通過與外顯子8的3′端剪接位點結(jié)合而增加SMN2 mRNA中外顯子7的保留。隨后又鑒定了多個剪接調(diào)控位點，其中一個重要剪接調(diào)節(jié)位點位于SMN2基因內(nèi)含子7中，稱為ISS-N1，還有內(nèi)含子7內(nèi)的ISS-N2，內(nèi)含子6中的Element 1和與ISS-N1部分重疊的GC富集序列[13, 14]。 研究證實，在成纖維細胞中，ASO誘導的ISS-N1阻斷可明顯增強細胞中SMN2外顯子7的包含，并使得細胞內(nèi)SMN蛋白質(zhì)增加，同時體內(nèi)實驗證實ASO可高效增加SMN2外顯子7的包含和小鼠全長SMN蛋白質(zhì)表達水平[15]。但是全身給藥后發(fā)現(xiàn)ASO未能穿透小鼠血-腦脊液屏障，研究者通過腦室內(nèi)直接注射的辦法克服了這一障礙，使得小鼠脊髓中的全長SMN mRNA和蛋白質(zhì)表達水平增加。

目前已有多個處于臨床前研究階段的基于ASO的SMA療法。如嗎啉基反義寡核苷酸，可靶向內(nèi)含子阻遏物Element1進而提高SMA小鼠的存活率[16]。Lorson等設計了一個雙功能RNA，此雙功能RNA含有一個針對內(nèi)含子7 /外顯子8連接點的ASO和另外一個可以募集hnRNP-A1的序列，hnRNP-A1是阻止外顯子8包含的剪接因子，研究證實這種雙功能RNA分子和其他雙功能RNA的腦室內(nèi)注射同樣能夠提高腦中全長SMN蛋白質(zhì)水平[17]。反式剪接RNA(trans-splicing RNA，tsRNA)是基于寡核苷酸的另一個策略， SMA治療性tsRNA是一種合成的RNA分子，可以與內(nèi)源性SMN2前體mRNA相互作用，導致雜交mRNA內(nèi)源性突變，從而產(chǎn)生更多全長SMN mRNA和蛋白質(zhì)。目前tsRNA在SMA小鼠模型也已成功應用[18]。

在眾多ASO中，最值得一提的就是Nusinersen即Spinraza，Spinraza是一種2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)修飾的反義寡核苷酸，最初由IONIS Pharmaceuticals公司開發(fā)，設計用于結(jié)合SMN2前體mRNA內(nèi)含子7中的內(nèi)含子剪接沉默子，使負性剪接因子hnRNP A1/A2被置換且不能與SMN2前體mRNA結(jié)合，從而產(chǎn)生全長mRNA和完整的功能蛋白[19]，臨床前試驗的成功促使IONIS Pharmaceuticals與Biogen聯(lián)合開發(fā)這種藥物用于治療SMA。經(jīng)過3個階段的臨床試驗，全面評估了SMA患者鞘內(nèi)注射的安全性、耐受性、藥代動力學和臨床效果[20, 21]。基于3個階段試驗的積極數(shù)據(jù)，2016年12月，美國FDA批準SPINRAZATM(Nusinersen)作為迄今為止第1個也是唯一一種用于SMA的遺傳治療藥物。

3.基因治療：SMA作為一種單基因疾病，基因治療有望徹底治愈SMA。病毒載體介導的SMN基因轉(zhuǎn)移在臨床前研究中已經(jīng)非常成功。Foust等利用自身互補腺相關病毒血清型9(scAAV9)作為載體成功拯救了SMA小鼠，這是SMA基因治療發(fā)展的一個里程碑[22]。本研究中，SMA小鼠出生后第1天，靜脈內(nèi)注射攜帶SMN1基因的scAAV9，分析發(fā)現(xiàn)有60%的脊髓運動神經(jīng)元表達SMN1蛋白質(zhì)，且完全改善了肌肉的運動功能和強度，治療后的小鼠壽命>400天，而未治療組小鼠壽命僅有16天。目前，這種方法已被其他多個研究組所重復[23]。但是，值得注意的是這種方法有嚴格的治療窗口期，隨著年齡的增長，治療效果迅速下降，出生后第5天注射只有部分效果，而在出生后第10天注射幾乎沒有效果，意味著設計基于SMN增強表達的療法，無論是通過基因治療方法還是其他方式，疾病早期診斷非常關鍵，在臨床癥狀出現(xiàn)之前要早診斷早治療。這一觀察結(jié)果同時提示，在個體發(fā)育過程中可能存在關鍵時期，其間足夠的SMN蛋白質(zhì)對于運動神經(jīng)元發(fā)育是必需的。

AveXis Inc. 基因治療公司正在美國進行一項臨床研究，這是第1個評估靜脈輸送scAAV9-SMN1至1型SMA患者的安全性的Ⅰ期臨床試驗[24]。這項研究總共有15例SMA嬰兒參與進來; 參與者分成兩組，其中3例患者接受低劑量(6.7×1013vg/kg)治療，12例接受高劑量(2.0×1014vg/kg)治療。截至2017年8月7日，所有15例患者在20個月大時仍然存活并無安全事件發(fā)生，而歷史隊列中存活率僅為8%。 在高劑量組，基因治療后進行費城兒童醫(yī)院神經(jīng)肌肉障礙測試(Children′s Hospital of Philadelphia infant test of neuromuscular disorders，CHOP INTEND)記錄運動功能評分(范圍0～64，分數(shù)越高表明功能越好)，1個月時增加了9.8個點，3個月時增加了15.4個點，與此相比， 歷史隊列CHOP INTEND評分逐漸降低。在接受高劑量治療的12例患者中，11例能夠端坐，9例可以翻身，11例能由口進食并且說話，2例能夠獨立走路。2018年1月16日AveXis Inc. 公司又公布了針對SMN基因候選療法AVXS-101的擴大臨床試驗計劃。除正在開展的對1型患者的關鍵試驗(STRIVE)和針對2型患者的1期試驗(STRONG)外，公司計劃再啟動3項試驗，涵蓋新的SMA患者群體，針對AVXS-101進行更加深入的評估。此外，該公司還宣布針對2型患者的1期試驗已經(jīng)完成了首位患者的用藥。良好的臨床結(jié)果促使諾華公司于2018年4月宣布以87億美元的價格收購AveXis Inc. 公司，諾華將與AveXis的團隊一起建設基因治療平臺，以推動越來越多的治療領域的基因治療藥物。

4.其他治療藥物：(1)神經(jīng)保護性藥物:Olesoxime是一種低分子藥物，研究顯示出神經(jīng)保護及促進神經(jīng)突觸生長的特性。體外研究表明，在營養(yǎng)因子剝奪試驗中使用olesoxime可以提高神經(jīng)元細胞存活率。此外，在肌萎縮性側(cè)索硬化的SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，與對照處理相比，用olezoxime處理小鼠可防止體重減輕及嚴重肌肉功能衰退，并且使得小鼠壽命增加10%。這種藥物已經(jīng)在2013年完成了第2階段隨機、多中心、雙盲安慰劑對照試驗。在歐洲不同國家的23個地點招募了165例3～25歲的2型和3型SMA患者，進行了為期2年的研究。結(jié)果表明，olesoxime能有效保持運動功能，并改善2年治療期間的總體健康狀況。目前正在進行一項由Hoffmann-La Roche發(fā)起的開放性試驗研究，該研究將評估患者接受olesoxime 治療后的安全性、耐受性和有效性預計將在2020年12月完成。(2)骨骼肌肌鈣蛋白激活藥物：肌節(jié)是骨骼肌的收縮單位，鈣離子(Ca2+)是信息傳遞過程中的關鍵調(diào)節(jié)離子，肌鈣蛋白復合物中Ca2+與肌鈣蛋白C的結(jié)合使得原肌球蛋白運動、肌動蛋白與肌球蛋白相互作用和肌肉收縮，由于Ca2+釋放的水平與神經(jīng)肌肉傳導的幅度以及肌收縮力呈正比，因此控制Ca2+的釋放成為治療SMA和其他骨骼肌肉相關疾病的靶點。美國Cytokinetics Inc公司與英國安斯泰來公司合作開發(fā)了CK-2127107(CK-107)，這種藥物主要就是通過減緩骨骼肌纖維中肌鈣蛋白復合物釋放鈣的速率，從而改善SMA患者的肌肉功能和身體狀況。Ⅰ期臨床試驗測試了CK-2127107藥物的安全性、藥代動力學和藥效學。目前該藥物正在進行二期臨床研究，納入對象為青少年骨骼肌疲勞患者以及SMA 2型、3型和4型的成年患者，主要在美國和加拿大招募患者。(3)干細胞治療:一旦運動神經(jīng)元死亡，可嘗試通過干細胞移植來恢復其功能，其目標之一是通過遞送神經(jīng)保護劑來支持內(nèi)源性運動神經(jīng)元，并且最理想的預期結(jié)果是部分恢復神經(jīng)元細胞和非神經(jīng)元細胞。通過鞘內(nèi)注射脊髓前角來源的神經(jīng)干細胞至SMA小鼠，遷移到實質(zhì)的神經(jīng)干細胞產(chǎn)生了一小部分運動神經(jīng)元，治療小鼠表現(xiàn)出運動能力和神經(jīng)肌肉功能的改善，而且預期壽命增加38%。盡管神經(jīng)干細胞移植在小鼠中獲得了良好的結(jié)果，其在人類疾病中的作用尚不清楚。目前在動物模型中也嘗試了其他替代方案，其中包括使用胚胎干細胞或誘導多能干細胞進行移植，這些細胞具有在體外和體內(nèi)分化成神經(jīng)干細胞和運動神經(jīng)元的能力，但是該策略應用于人的SMA治療還為時尚早。

四、展 望

SMA作為導致嬰兒死亡的最主要遺傳病，在其致病基因發(fā)現(xiàn)21年后，第1個用于治療SMA的藥物SPINRAZATM最終成功上市，雖然這對于患者及家屬都是一大好消息，但是SPINRAZATM仍然不能最終治愈SMA。目前SMA治療的研究領域正在迅速擴展，上述治療方案以及最近完成的AVXS-101一期臨床試驗的結(jié)果令人非常鼓舞，但仍有幾個問題尚未解決。一個問題是運動神經(jīng)元發(fā)育是否存在缺陷，運動神經(jīng)元功能是否進行性喪失，或者兩者兼有。所有這些方法的最佳干預時間在人類中并不清楚，特別是在這種情況下，是否存在不可逆轉(zhuǎn)的病理變化，事實上，盡管在SMA小鼠模型的幾項研究中確定了治療時間和療效之間的精確關系，但在人類中是否也是如此目前還不能確定。另外這些療法的臨床效應是否會持續(xù)下去也不清楚，特別是在成長的兒童中。此外，動物模型和有限的患者病例報告提供的證據(jù)表明，SMA病理改變不僅限于運動神經(jīng)元，還涉及骨骼肌、神經(jīng)肌肉接頭和中間神經(jīng)元等，由于SMA最嚴重后果是全身器官功能障礙或結(jié)構(gòu)改變，目前尚不能確定靶向運動神經(jīng)元而不是全身組織的治療是否會隨著時間的推移而導致多器官功能障礙的發(fā)生。