siRNA沉默Skp2基因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞生物學(xué)行為影響及機(jī)制

郭云霞 秦寶山 馮軍安 韓 莉 王志凌 王郁杰

肝癌在我國發(fā)生率較高，而浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是該病惡化和死亡的重要原因[1，2]。研究表明，肝癌的發(fā)生與部分基因異常表達(dá)有關(guān)[3]。Skp2基因位于5p13，與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[4，5]，其中Skp2蛋白能特異性識(shí)別泛素連接酶復(fù)合物的底物，并將其磷酸化促進(jìn)泛素化降解及細(xì)胞周期從G1期向S期過渡，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖[6]。已有研究表明，Skp2高水平者其預(yù)后差，多變量分析顯示，Skp2 mRNA表達(dá)水平可以作為肝癌患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[7，8]。然而目前Skp2基因沉默后調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的分子機(jī)制仍然未知。本研究采用siRNA方法沉默Skp2的表達(dá)，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：人肝癌HepG2細(xì)胞(齊氏生物科技有限公司)。Skp2 Human siRNA(美國Origene公司)。BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。MMP2、MMP9 ELISA試劑盒(武漢博士德公司)；Lipofectamine TM2000 (美國Invitrogen公司)。兔抗人caspase-3、P27蛋白抗體、羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)。

2.實(shí)驗(yàn)方法： (1)組織標(biāo)本的采集：選取2010年1月～2017年1月筆者醫(yī)院病理科明確診斷的16例肝癌組織標(biāo)本。取同期配對(duì)且病理分析為正常組織的癌旁組織16例作為對(duì)照組。所有患者年齡在38～87歲，平均年齡為69.43±7.25歲。標(biāo)本采集均告知患者并簽署知情同意書，并經(jīng)筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HepG2細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化、傳代。將1×104個(gè)/ml細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上時(shí)，將培養(yǎng)基換成無血清無雙抗的培養(yǎng)基，并根據(jù)Lipofectamine TM2000使用說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞操作。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，PBS 洗去轉(zhuǎn)染試劑，改換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3組：對(duì)照組(僅有空載體)、NC-Skp2組(僅含有SKP2陰性序列)、siRNA-Skp2組(含有Skp2基因干擾序列)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(3) qRT-PCR：Trizol裂解人肝癌組織、癌旁組織或細(xì)胞系，4℃、12000g離心10min，吸取水相層，按每毫升最初的Trizol加入0.5ml異丙醇，4℃、12000g離心10min，棄上清，所得沉淀即為 RNA，并測(cè)定純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA。反應(yīng)體系為20μl，其中BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2×)10μl，上游(3μmol/L)和下游(3μmol/L)2μl，cDNA2μl，PCR級(jí)高純水6μl。采用light cycleR96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃2 min ；95℃變性15s，60℃退火 25s，60℃延伸 30s，共40 個(gè)循環(huán)。引物序列由上海英駿公司提供。Skp2上游序列：5′-GCTGAACATTTCAGTACTCTCGC-3′，下游序列：5′-GTCTCTGACACATGCGCAAC -3′，產(chǎn)物大小194p；內(nèi)參 GAPDH上游引物：5′-CCACTAGGCGCTCACTGTT-3′，下游引物：5′- TGGAATTTGCCATGGGTGGA -3′，長(zhǎng)度228bp。SKP2相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct×100%，△Ct=Ct(待測(cè)基因)-Ct(GAPDH)。(4)CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度為1×104個(gè)/ml細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72、96h，每孔加入CCK-8 10μl，培養(yǎng)2h各孔細(xì)胞在450nm測(cè)定吸光度A值，另設(shè)空白對(duì)照組調(diào)零，計(jì)算抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，胰酶消化，1000×g離心5min，收集細(xì)胞，PBS重懸計(jì)數(shù)，5×104重懸細(xì)胞，1000×g離心5min，加入結(jié)合液500μl重懸細(xì)胞，加入Annexin Ⅴ-FITC5μl，然后加入PI 5μl，混勻，室溫孵育10min，隨即行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。(6) Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲力：Transwell 上室膜面鋪上 Matrigel。將分組干預(yù)72h的細(xì)胞采用胰酶消化，調(diào)整，每孔上室加入細(xì)胞密度為4×104的無血清培養(yǎng)基100μl，每孔下室加入10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基500μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棉簽刮凈濾膜上層細(xì)胞，100%多聚甲醛固定10min，染色，拍照計(jì)數(shù)。(7) ELISA法測(cè)定檢測(cè) MMP2和MMP9水平：對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，收集細(xì)胞上清。等比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每孔加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品100μl，置37℃孵育1.5h。每孔添加生物素標(biāo)記抗體100μl，置37℃孵育1h。然后0.01mol/L TBS洗滌3次。每孔加過氧化物酶孵育1h， TMB37℃避光反應(yīng)0.5h，加入TMB終止液，在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm波長(zhǎng)處，測(cè)各孔吸光度(A)值。(8)Western blot法檢測(cè)caspase-3、P27的表達(dá)：常規(guī)方法提蛋白質(zhì)，調(diào)整各樣本蛋白總量，參照說明書進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，參照規(guī)程分別孵育一抗和二抗，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，以β-actin為內(nèi)參分析待測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)值。

結(jié) 果

1.Skp2 mRNA在肝癌組織中的表達(dá)：利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)肝組織中Skp2 mRNA表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果顯示肝癌組織中Skp2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為3.68±1.47，癌旁組織為1.10±0.47，其中肝癌組織中Skp2 mRNA水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)。

2.siRNA-Skp2沉默HepG2細(xì)胞中Skp2的mRNA的表達(dá)：qRT-PCR結(jié)果顯示，空白對(duì)照組Skp2mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.42±0.06，NC- Skp2組為2.40±0.05。siRNA-Skp2組為1.07±0.05。與NC-Skp2組和空白對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2后，siRNA-Skp2組的Skp2的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05,圖1)。

3.轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響：CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和NC-Skp2組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2后，siRNA-Skp2組的增殖率明顯下調(diào)(P<0.05)，而空白對(duì)照組和NC-Skp2組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響與NC-Skp2組比較，*P<0.05

4.轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在轉(zhuǎn)染72h后，空白對(duì)照組、NC- Skp2組和siRNA-Skp2組的細(xì)胞凋亡率分別為3.12%±0.74%、3.83%±1.14%、20.42%±1.24%。與空白對(duì)照組和NC- Skp2組比較，siRNA-Skp2組的細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào)(P<0.05，圖2)。

5.轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)細(xì)胞的侵襲力的影響：采用Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲力，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染72h后，空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為31.52±3.12；NC-Skp2組細(xì)胞數(shù)為30.27±1.42；siRNA-Skp2組細(xì)胞數(shù)為8.23±2.47。與空白對(duì)照組和NC-Skp2組比較，siRNA-Skp2組的細(xì)胞侵襲力明顯下調(diào)(P<0.05，圖3)。

圖2 Skp2對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Skp2對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲力的影響

6.轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲蛋白的影響：采用ELISA法檢測(cè)MMP2和MMP9水平，在轉(zhuǎn)染72h后，與空白對(duì)照組和NC-Skp2組比較，siRNA-Skp2組的細(xì)胞分泌MMP2和MMP9能力明顯下調(diào)(P<0.05，圖4)。

7.轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)HepG2細(xì)胞中caspase-3、P27的表達(dá)影響：采用Western blot法檢測(cè)caspase-3、P27蛋白水平，在轉(zhuǎn)染72h后，與空白對(duì)照組和NC-Skp2組比較，siRNA-Skp2組的caspase-3、P27的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05，圖5，圖6)。

討 論

Skp2 為F-box家族的成員，對(duì)細(xì)胞G1～S 期具有特異性的調(diào)控作用，并已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[9,10]。李勝等[11]采用Skp2 RNA干擾表達(dá)載體降低Skp2蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明，干預(yù)組細(xì)胞的肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)較陰性對(duì)照組明顯降低，而凋亡率較陰性對(duì)照組明顯增加。在喉癌組織中也觀察到相似的結(jié)果[12]。Xu等[13]通過沉默Skp2基因表達(dá)水平，膀胱癌T24細(xì)胞增殖和侵襲受到顯著抑制。目前，已有研究表明，Skp2在肝癌組織中的中的陽性表達(dá)明顯高于癌旁組織，但其機(jī)制并不太明確[8]。本研究結(jié)果顯示，Skp2 mRNA在肝癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，這與相關(guān)研究一致。為了進(jìn)一步研究Skp2在肝癌的進(jìn)展中的作用，將體外合成的siRNA-Skp2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72h后，采用qRT-PCR分析靶基因Skp2的mRNA水平變化。結(jié)果表明，siRNA-Skp2能有效降低Skp2基因表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲蛋白的影響與NC-Skp2組比較，*P<0.05

圖5 轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)caspase-3、P27蛋白表達(dá)的影響

圖6 轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2對(duì)caspase-3、P27蛋白水平的影響與NC-Skp2組比較，*P<0.05

已有研究表明，P27低表達(dá)與高度侵襲性腫瘤相關(guān)，而P27高水平可以抑制癌細(xì)胞的增殖[14]。本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2后HepG2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明siRNA-Skp2能有效的抑制HepG2細(xì)胞的增殖。而且實(shí)驗(yàn)還觀察到轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2 72h后，HepG2細(xì)胞中Skp2表達(dá)水平下調(diào)的同時(shí)，P27蛋白水平反而上升，這也間接說明Skp2可能通過P27蛋白信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖。當(dāng)然，腫瘤細(xì)胞能在機(jī)體內(nèi)快速增值與細(xì)胞凋亡受到抑制也存在一定的關(guān)系。為了進(jìn)一步研究Skp2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用流式細(xì)胞儀分析了siRNA-Skp2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后的凋亡情況。結(jié)果siRNA-Skp2可有效的促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，提示Skp2在抗腫瘤細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。而且siRNA-Skp2轉(zhuǎn)染72h后，凋亡蛋白caspase-3也顯著增加，表明Skp2下調(diào)后可通過caspase信號(hào)通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

為了研究siRNA-Skp2轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞體外侵襲力的影響，本研究采用Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲力。結(jié)果顯示，siRNA-Skp2可有效降低HepG2細(xì)胞體外侵襲能力。已有研究表明，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的消化與腫瘤的侵襲有關(guān)[15,16]。腫瘤細(xì)胞分泌的MMP家族成員可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成分[17～19]。而且也有文獻(xiàn)顯示沉默Skp2后可下調(diào)MMP2和MMP9的分泌，進(jìn)而抑制腫瘤的侵襲能力[20]。本研究通過MMP2和MMP9水平檢測(cè)也表明，轉(zhuǎn)染siRNA-Skp2后，HepG2細(xì)胞分泌MMP2和MMP9的能力明顯降低。因此，降低Skp2表達(dá)水平，可通過降低MMP2和MMP9的分泌，抑制肝癌的侵襲力。

總之， Skp2基因沉默后肝癌HepG2細(xì)胞增殖和侵襲能力下降，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，其機(jī)制可能與調(diào)控P27、caspase-3、MMP2和MMP9有關(guān)。因此，抑制Skp2的表達(dá)，也可能成為肝癌基因治療的新策略。