MALAT-1沉默對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及caspase-3表達(dá)的影響

王 陽(yáng) 曹志華 劉 磊 谷傲錚

膀胱癌是世界范圍內(nèi)第五大常見(jiàn)的腫瘤，也是泌尿外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1，2]。近年來(lái)隨著生活節(jié)奏的加快，膀胱癌發(fā)生率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)，其中，城市人口發(fā)生率高于農(nóng)村[3，4]。膀胱癌在組織學(xué)分類中主要有尿路上皮細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺細(xì)胞癌等，其中，以尿路上皮細(xì)胞癌最為常見(jiàn)[5，6]。目前臨床上對(duì)于膀胱癌的治療以手術(shù)切除為主，但預(yù)后性較差，且有較高的惡化和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，而且，膀胱癌初期癥狀比較隱匿，容易被忽視，很多患者診斷出來(lái)時(shí)就已是中晚期[7，8]。因此，尋找更精確有效的膀胱癌診斷、篩查、治療靶點(diǎn)，是治療膀胱癌的當(dāng)務(wù)之急。

肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT-1)是非編碼RNA——lncRNA家族的一員[9]，有研究證明其在多種惡性腫瘤上表達(dá)豐富，并與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，可以作為腫瘤早期診斷的指標(biāo)，也可能成為將來(lái)腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[10，11]。盡管已有報(bào)道證實(shí)MALAT-1與多種腫瘤密切相關(guān)，但對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞行為的影響尚未有大量報(bào)道。因此，本研究旨在探討MALAT-1在正常膀胱組織和膀胱癌組織中表達(dá)的差異，及MALAT-1對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞增殖、凋亡的影響，及其可能存在的作用機(jī)制。

材料與方法

1.臨床標(biāo)本采集:(1)膀胱癌組織：來(lái)源于2017年1月～2017年10月期間于筆者醫(yī)院泌尿外科行膀胱癌手術(shù)切除，并經(jīng)病理檢驗(yàn)確診為尿路上皮癌的患者，共16例，其中男性9例，女性7例，患者年齡45～68歲，平均年齡56.68±10.39歲，16例患者在手術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放射治療或化學(xué)治療。另收集16例遠(yuǎn)離腫瘤組織至少3cm以上的癌旁組織，且經(jīng)病理診斷為正常膀胱組織，其中男性患者8例，女性患者8例，患者年齡43～70歲，平均年齡58.05±12.11歲，16例患者在手術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放射治療或化學(xué)治療。標(biāo)本離體后立即投入液氮保存。本研究經(jīng)過(guò)筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。(2)細(xì)胞株：人膀胱癌EJ細(xì)胞系購(gòu)自上海榕柏生物技術(shù)有限公司。(3)試劑：含雙抗的1640培養(yǎng)基，胎牛血清(上海Gibco公司)；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；caspase-3引物由上海生工生物工程有限公司合成；MALAT-1抗體、GAPDH抗體(上海艾博抗貿(mào)易有限公司)；RNAi MAX 轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó) Invitrogen公司)；MALAT-1-si RNA合成(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；CCK-8試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；TUNEL免疫熒光檢測(cè)試劑盒(兔)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。(4)儀器:恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(國(guó)營(yíng)創(chuàng)新醫(yī)療器械廠)；電子天平(北京市六一儀器廠)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；高速離心機(jī)(北京興聯(lián)商貿(mào)有限公司)；DYC-p32型電泳槽(北京市六一儀器廠)；Lecia DC300F顯微照像系統(tǒng)(德國(guó)Lecia公司)。

2.實(shí)驗(yàn)步驟:(1)RT-PCR檢測(cè)膀胱癌組織及正常膀胱組織中MALAT-1基因的表達(dá):將凍存的組織剪成小塊，用Trizol從組織中提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2μl RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：內(nèi)參為GAPDH，內(nèi)參引物序列：Sense：5′-CAGGTAGCTACGGTAACGTACT-3′；Antisene：5′-ATCGATCGATACTTCGGGTTAA-3′。MALAT-1mRNA的引物序列：Sense：5′-CAGACTAGCATTAGCGCATTG-3′；Antisense：5′-CAGGGCATGCCATTGCCTGA-3′；擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性2min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸6min。取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳條帶，分析目的基因和參比基因的條帶灰度值。(2)體外實(shí)驗(yàn)：①細(xì)胞復(fù)蘇及傳代:將人膀胱癌EJ細(xì)胞復(fù)蘇重懸后，轉(zhuǎn)移至含雙抗和10%FBS的1640培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中傳代，取2～3次傳代后的細(xì)胞用于下一步操作；②細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將RNAiMAX與MALAT-1-si RNA分別用不含F(xiàn)BS的Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋后混合，室溫下孵育20min以形成復(fù)合物，將該復(fù)合物加入到接種含有人膀胱癌EJ細(xì)胞但不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基的6孔板中，細(xì)胞密度為8×104/孔，輕晃培養(yǎng)板使其混合均勻。在37℃、5%CO2環(huán)境中孵育24h后，更換含有10%FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，構(gòu)建MALAT-1沉默及MALAT-1正常表達(dá)的人膀胱癌EJ細(xì)胞系；③CCK-8比色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖:將MALAT-1沉默及MALAT-1正常表達(dá)的人膀胱癌EJ細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔內(nèi)細(xì)胞濃度調(diào)整至2×103/100μl，并在培養(yǎng)板四周設(shè)置只含有培養(yǎng)基不含細(xì)胞的空白對(duì)照孔。將兩組細(xì)胞培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(36、48、72h，各時(shí)間點(diǎn)包含6個(gè)復(fù)孔)后，在各時(shí)間段結(jié)束時(shí)快速向孔中加入10μl的CCK-8溶液，將96孔板在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔細(xì)胞懸液在450nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；④TUNEL免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將MALAT-1沉默及MALAT-1正常表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(36、48、72h，各時(shí)間點(diǎn)包含6個(gè)復(fù)孔)后，用PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30min后PBS洗滌，加入含0.1%TritonX-100的PBS在冰浴條件下孵育2min，然后加入TUNEL檢測(cè)液，室溫下避光孵育1h，在熒光顯微鏡下觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);⑤Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)：將MALAT-1沉默及MALAT-1正常表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)72h后，蛋白裂解液冰浴中裂解，離心后取上清液，經(jīng)SDS-PAGE電泳條件分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉孵育NC膜，按順序加入一抗、二抗，TBST洗滌NC膜，ECL顯色，將膠片掃描后用Bandscan5.0軟件進(jìn)行灰度分析。

結(jié) 果

在正常膀胱組織中，MALAT-1基因條帶灰度值為0.193±0.026，膀胱癌組織中，MALAT-1基因條帶灰度值為0.395±0.059，顯著高于正常膀胱組織(P<0.05),詳見(jiàn)圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)正常膀胱組織及膀胱癌組織中MALAT-1的表達(dá)與正常膀胱組織比較，*P<0.05

MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)36h后，MALAT-1正常表達(dá)的細(xì)胞抑制率為6.44%±0.25%，MALAT-1沉默的細(xì)胞抑制率為11.03%±0.87%，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)的細(xì)胞(P=0.000)；經(jīng)培養(yǎng)48h后，MALAT-1正常表達(dá)的細(xì)胞抑制率為5.87%±1.35%，MALAT-1沉默的細(xì)胞抑制率為9.47%±1.74%，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)的細(xì)胞(P=0.000)；經(jīng)培養(yǎng)72h后，MALAT-1正常表達(dá)的細(xì)胞抑制率為5.58%±1.03%，MALAT-1沉默的細(xì)胞抑制率為8.57%±2.01%，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)的細(xì)胞(P=0.000),詳見(jiàn)表1。

MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)36h后，在顯微鏡相同視野下，MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為9.37±2.19，MALAT-1沉默細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為17.62±4.23，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞(P<0.05)；經(jīng)培養(yǎng)48h后，MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為18.96±4.39， MALAT-1沉默細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為31.74±6.43，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞(P<0.05)；經(jīng)培養(yǎng)72h后，MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為32.57±5.33，MALAT-1沉默細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為58.06±6.92，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞(P<0.05),詳見(jiàn)圖2。

表1 MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后的生長(zhǎng)抑制情況

圖2 MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后TUNEL染色圖示及數(shù)據(jù)與MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞比較，*P<0.05

MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ細(xì)胞培養(yǎng)72h后，MALAT-1沉默細(xì)胞caspase-3蛋白條帶灰度值為0.754±0.082，MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞caspase-3蛋白條帶灰度值為0.316±0.088，顯著低于MALAT-1沉默細(xì)胞(P<0.05)，詳見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot法檢測(cè)MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)與MALAT-1正常表達(dá)比較，*P<0.05

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，對(duì)人類的健康造成了極大的威脅[1～3]。由于膀胱癌早期癥狀不明顯，且臨床上對(duì)膀胱癌的早期診斷尚未找到敏感合適的指標(biāo)，以至于很多患者診斷出膀胱癌時(shí)已是中晚期[4,5]。此外，臨床上對(duì)膀胱癌的治療以手術(shù)切除為主，但易復(fù)發(fā)，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，并不能從根本上改善患者的生存質(zhì)量，因此，尋找敏感且有效的靶向指標(biāo)，是早期診斷、有效治療膀胱癌的當(dāng)務(wù)之急[12，13]。

肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT-1)是一個(gè)長(zhǎng)約8000nt的非編碼RNA，首次在肺癌組織中被發(fā)現(xiàn)[10，11]。其在人類多種組織中廣泛表達(dá)，尤其在腫瘤組織中的表達(dá)異常豐富[15，16]。有研究報(bào)道，MALAT-1能參與胃癌、胰腺癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)，調(diào)控其增殖、凋亡和遷移[16～20]，但對(duì)MALAT-1在膀胱癌組織及細(xì)胞中的作用尚未有大肆報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了人正常膀胱組織和膀胱尿路上皮癌組織中MALAT-1基因的表達(dá)，MALAT-1基因在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)顯著高于正常膀胱組織，此結(jié)果提示MALAT-1在膀胱尿路上皮癌的發(fā)病過(guò)程中可能起到了重要作用。

為了進(jìn)一步探討MALAT-1在膀胱癌細(xì)胞行為中所扮演的角色，本研究擬沉默MALAT-1觀察其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡所造成的影響，通過(guò)用MALAT-1-si RNA轉(zhuǎn)染人膀胱癌EJ細(xì)胞，構(gòu)建MALAT-1沉默細(xì)胞系，用CCK-8法檢測(cè)其與MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞系增殖能力的差異，結(jié)果顯示，MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)36h后，MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞抑制率為6.44%±0.25%，MALAT-1沉默細(xì)胞抑制率為11.03%±0.87%，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞(P=0.000)；經(jīng)培養(yǎng)48h后，MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞抑制率為5.87%±1.35%，MALAT-1沉默細(xì)胞抑制率為9.47%±1.74%，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞(P=0.000)；經(jīng)培養(yǎng)72h后，MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞抑制率為5.58%±1.03%，MALAT-1沉默細(xì)胞抑制率為8.57%±2.01%，顯著高于MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞(P=0.000)，上述結(jié)果表明MALAT-1沉默可提高膀胱癌EJ細(xì)胞抑制率，提示MALAT-1參與了膀胱癌細(xì)胞的增殖過(guò)程，且具有一定的促進(jìn)作用。

與此同時(shí)，本研究檢測(cè)了MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ細(xì)胞的凋亡，在培養(yǎng)36、48和72h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果均顯示，在相同視野范圍內(nèi)，MALAT-1沉默細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞，上述結(jié)果提示MALAT-1沉默對(duì)人膀胱癌EJ細(xì)胞具有一定的促凋亡作用，可見(jiàn)MALAT-1不僅能促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增值能力，且對(duì)癌細(xì)胞的凋亡具有一定的抑制作用。

caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程各凋亡途徑的樞紐，也是最重要、最直接的調(diào)控因子[10,20]。為了進(jìn)一步探討MALAT-1抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡可能相關(guān)的作用機(jī)制，本研究將 MALAT-1正常表達(dá)和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ細(xì)胞培養(yǎng)72h后，檢測(cè)caspase-3蛋白在兩組細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示，MALAT-1沉默細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)量顯著高于MALAT-1正常表達(dá)細(xì)胞，表明隨著MALAT-1基因表達(dá)被抑制，人膀胱癌細(xì)胞中caspase-3被激活，說(shuō)明MALAT-1對(duì)caspase-3的表達(dá)具有抑制作用，而其對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的抑制作用可能正是由于抑制了caspase-3的表達(dá)。

綜上所述，MALAT-1在膀胱癌組織中的表達(dá)被激活，同時(shí)，MALAT-1能促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖，抑制膀胱癌細(xì)胞的凋亡，這種抑制作用可能是通過(guò)直接調(diào)控caspase-3的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。此外，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論提示MALAT-1可能在膀胱癌的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，并可能成為膀胱癌早期診斷、有效治療的一個(gè)新的作用靶點(diǎn)。