ISL-1誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞分化

張 健 黃從新

迄今為止，藥物治療和安裝電子起搏器挽救了很多緩慢性心律失常患者的生命，但長期藥物治療并不能解決根本問題而且存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)，電子起搏器也存在導(dǎo)線斷裂、電磁干擾、囊袋感染、電池壽命有限以及缺乏自主神經(jīng)反應(yīng)等問題。生物起搏器既避免了傳統(tǒng)治療方式的問題，又具有長期的神經(jīng)體液系統(tǒng)反應(yīng)，是更理想的緩慢性心律失?；颊叩闹委煼绞絒1]。

由于竇房結(jié)(sinoatrial node，SAN)的發(fā)育是多因素和多機(jī)制的結(jié)果，隨著基因工程和干細(xì)胞的研究進(jìn)展，聯(lián)合基因治療和細(xì)胞治療誘導(dǎo)胚胎發(fā)育通路再激活成為構(gòu)建生物起搏器的研究熱點(diǎn)[2～4]。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，憑借著來源廣泛，體內(nèi)儲備量大，取材容易，體外穩(wěn)定增生且衰亡率低，對機(jī)體損傷小，適宜自體移植等優(yōu)點(diǎn)，成為生物起搏的種子細(xì)胞[5, 6]。Rangappa等[7]首先證明30%的ADSCs在用5-氮雜胞苷處理2周后聚集形成具有自發(fā)收縮性的球狀結(jié)構(gòu)。隨后，Planat-Benard等[8]證實(shí)，ADSCs可以在沒有5-氮雜胞苷的甲基纖維素培養(yǎng)基中分化成能夠自發(fā)跳動的心肌細(xì)胞。Chen等[9]在未添加任何輔助試劑的條件下，培養(yǎng)的棕色ADSCs可以自發(fā)性搏動，表明棕色ADSCs可以向起搏樣細(xì)胞的分化，同時(shí)沉默Tbx18可終止棕色ADSCs分化為起搏樣細(xì)胞。表明ADSCs是否分化為起搏樣細(xì)胞可能取決于這些細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，提示著可從竇房結(jié)發(fā)育機(jī)制著手，關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)ADSCs向起搏樣細(xì)胞分化。

ISL-1是LIM同源轉(zhuǎn)錄因子，標(biāo)記著第二心臟區(qū)未分化的心臟祖細(xì)胞，對促進(jìn)心臟發(fā)育和分化起著非常重要的作用。Vedantham等[10]利用RNA測序技術(shù)證實(shí)ISL-1調(diào)控著小鼠竇房結(jié)的早期發(fā)育。Dorn等[11]研究也證實(shí)了ISL-1在小鼠胚胎干細(xì)胞或非洲爪蟾胚胎中過度表達(dá)會導(dǎo)致竇房結(jié)特異性基因的上調(diào)和工作心肌基因的下調(diào)。Liang等[12]利用ISL-1基因敲除小鼠，證實(shí)ISL-1在多種竇房結(jié)起搏功能必需的基因中均存在結(jié)合位點(diǎn)，對起搏細(xì)胞的發(fā)育和功能方面均有影響。因此，多項(xiàng)研究表明，ISL-1位于多種轉(zhuǎn)錄因子及離子通道上游并調(diào)控SAN特異性基因表達(dá)，本研究旨在聯(lián)合生物起搏基因治療和細(xì)胞治療，探索ISL-1是否能在體外成功誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞分化，并初步探討相應(yīng)機(jī)制，為生物起搏尋求新的突破點(diǎn)。

材料與方法

1.材料：SD雄性大鼠10只(體質(zhì)量約100～150g)，出生后1～3天的SD乳鼠60～100只，雌雄不限，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(鄂)20150018。胎牛血清(美國Gibcao公司)，Ⅱ型膠原酶(武漢Biosharp公司)，Ⅰ型膠原酶(中國Biosharp公司)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(美國Sigma公司)，DMEM/F-12培養(yǎng)基，胰酶細(xì)胞消化液(武漢碧云天公司)，攜帶ISL-1基因的慢病毒質(zhì)粒由上海吉凱基因科技有限公司提供，攜帶Tbx18基因的慢病毒質(zhì)粒由上海漢恒生物科技有限公司提供，大鼠HCN4單克隆抗體(英國Abcam公司，ab32675)，Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(英國Abcam公司，ab150159)，Trizol試劑、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR引物)，細(xì)胞培養(yǎng)箱、37℃水浴鍋、超高分辨共聚焦熒光顯微鏡(德國萊卡，Leica-LCS-SP8-STED)，電泳儀、電泳槽、膜片鉗系統(tǒng)。

2.慢病毒載體的構(gòu)建及擴(kuò)增：從基因文庫查詢目的基因ISL-1序列，化學(xué)合成cDNA并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，將酶切好的慢病毒載體與ISL-1片段連接，得到重組慢病毒質(zhì)粒Ubi-MCS-ISL-1-3FLAG-SV40-Cherry。然后將其轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌株，將轉(zhuǎn)化后的ISL-1平板挑菌，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，用293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，直至獲得大量純化的ISL-1慢病毒。進(jìn)行效價(jià)測定，純化病毒效價(jià)至1×108TU/ml。

3.ADSCs的分離和培養(yǎng)：3～4周齡雄性SD大鼠，體重約100～150g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。采用0.1%的Ⅰ型膠原酶胰酶消化法分離ADSCs，懸浮細(xì)胞經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，按細(xì)胞密度1×106cells/ml接種于培養(yǎng)皿后置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后首次換液，以后隔天換液，貼壁細(xì)胞至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，期間應(yīng)用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

4.慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的測定：首先確定最適感染復(fù)數(shù)(即MOI值)，將第3～5代ADSCs種于24孔板內(nèi)，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)各孔至相同數(shù)量，根據(jù)MOI值0、20、50、80、100分別加入ISL-1基因的慢病毒和陰性對照組病毒液+感染增強(qiáng)液(enhanced infection solution，ENI.S.)+助染劑(Polybrene)的混合液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8～12h后將換回常規(guī)培養(yǎng)基，48h后熒光顯微鏡下觀察，72～96h用流式細(xì)胞儀測病毒轉(zhuǎn)染效率，確定本實(shí)驗(yàn)的最適MOI進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.NRVMs的分離與共培養(yǎng)：1～3日齡SD乳鼠，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。采用0.125%胰酶+Ⅱ型膠原酶消化法分離心室肌細(xì)胞，90min差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，前2天加入終濃度0.0031%(0.1mmol/L)的5-溴脫氧尿核苷(Brdu)，抑制成纖維細(xì)胞生長，心肌細(xì)胞的接種濃度為5×105cells/ml，48h后首次換液時(shí)，分別與各組轉(zhuǎn)染成功的NRVMs共培養(yǎng)(ADSCs∶NRVMs=1∶10)，以后每隔48h換液，觀察細(xì)胞形態(tài)和搏動頻率變化。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析：共培養(yǎng)7天后用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后按照Life Technologies公司的StepOneTMReal-time PCR的操作說明和SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行(日本TaKaRa公司)的說明書進(jìn)行熒光定量檢測，每個(gè)樣品均作3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1min，95℃變性15s，58℃退火20s，最后72℃延伸45s，共循環(huán)40次，溶解曲線從60～95℃，每20s升溫1℃，以GAPDH作為內(nèi)參，各指標(biāo)引物序列詳見表1。

表1 各基因的引物序列及產(chǎn)物長度

7.免疫熒光(immunofluorescence)：將細(xì)胞種入共聚焦皿共培養(yǎng)7天后，4%多氯甲醛室溫固定15min，用含0.2%riton X-100和0.3% H2O2的甲醇溶液封閉15min，2%BSA封閉15min后加入HCN4的一抗4℃過夜，熒光二抗室溫孵育1h，DAPI室溫核染10min后，抗熒光淬滅封片劑封片，超高分辨共聚焦熒光顯微鏡觀察并拍照。

8.全細(xì)胞膜片鉗分析：利用膜片鉗系統(tǒng)Axopatch-ID放大器和pCLAMP軟件在共培養(yǎng)5～7天后以全細(xì)胞模式記錄mcherry組和ISL-1組的起搏電流If。控制溫度約25℃，電極芯片電阻(2.0～3.5)MΩ，封接電阻(1～2)GΩ，鉗制電位-40mV，給予幅值-40mV→-140mV的超極化脈沖，階躍電壓為10mV，超極化電壓鉗制時(shí)間4s，最后回歸到+20mV，在+20mV處測尾電流。細(xì)胞外液: NaCl 135mmol/L, KCl 5.4mmol/L, CaCl21.8mmol/L,MgCl21.0mmol/L,glucose 10mmol/L, BaCl22.0mmol/L， HEPES 5.5mmol/L，用 NaOH 調(diào)至pH值為7.4。電極內(nèi)液：KCl 120mmol/L,CaCl25.0mmol/L,MgCl25.0mmol/L, HEPES 10mmol/L，EGTA 10mmol/L，用KOH調(diào)至pH值為7.3。封接破膜后形成全細(xì)胞記錄模式，所有記錄數(shù)據(jù)應(yīng)用pCLAMP 10.1軟件進(jìn)行處理。

結(jié) 果

1.ADSCs細(xì)胞形態(tài)觀察：剛分離的原代ADSCs以圓形為主，4～5h逐漸開始貼壁，24h后可見少量細(xì)胞貼壁，形態(tài)不規(guī)則，以多邊形和梭形為主，48h 后可見較多細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞以長梭形為主，較為扁平，可見個(gè)別折光率較高卵圓形細(xì)胞(圖1A)。5～7天后，細(xì)胞密度可達(dá)90%以上，形態(tài)為成纖維樣長梭形為主，大小略有不同，相鄰細(xì)胞向一定方向生長。消化傳代后，細(xì)胞生長呈梭形，突起減少，形態(tài)大小趨于一致，細(xì)胞呈束狀或漩渦狀排列，增殖速度較原代明顯增快，2～3天即可覆蓋約90%以上(圖1B)。

2.MOI值和轉(zhuǎn)染效率檢測：根據(jù)MOI值0、20、50、80、100分別加入帶ISL-1基因的慢病毒和陰性對照組病毒液+ENI.S.+Polybrene的混合液，48h后熒光顯微鏡結(jié)果顯示(圖1C)，轉(zhuǎn)染成功的ADSCs發(fā)出紅色熒光，隨著MOI值的升高，熒光的強(qiáng)度逐漸增加，MOI≥50時(shí)，轉(zhuǎn)染效率≥80%，同時(shí)細(xì)胞死亡數(shù)量也逐漸增加，與流式結(jié)果一致，綜合熒光強(qiáng)度和細(xì)胞毒性，確定本實(shí)驗(yàn)最適MOI=50(圖1D)。

圖1 ADSCs細(xì)胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染效率

3.細(xì)胞形態(tài)觀察和免疫熒光檢測HCN4的表達(dá)：共培養(yǎng)系統(tǒng)中光鏡下觀察，2天后可見轉(zhuǎn)染成功的ADSCs與NRVMs開始產(chǎn)生連接，形成少量的細(xì)胞簇，同簇中細(xì)胞同步搏動，5天后多數(shù)細(xì)胞連接成網(wǎng)狀，細(xì)胞成片搏動，7天后幾乎全部細(xì)胞形成連接并呈整體搏動。超高分辨率共聚焦熒光顯微鏡顯示，mCherry組細(xì)胞未見明顯HCN4表達(dá),形態(tài)大多以梭形為主，橫紋肌不明顯(圖2A)，而ISL-1組多數(shù)細(xì)胞可檢測到HCN4表達(dá)，主要分布在細(xì)胞膜和胞質(zhì)中，表現(xiàn)為大小不一，連續(xù)的熒光團(tuán)或熒光點(diǎn)，表達(dá)HCN4的ADSCs形態(tài)發(fā)生改變，伸出似心肌細(xì)胞樣偽足，主要為梭形、三角形和不規(guī)則形，其中以梭形最為常見，橫紋肌明顯(圖2B)。

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察ADSCs免疫熒光HCN4的表達(dá)

4.心臟相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平：qRT-PCR結(jié)果顯示，mCherry組和Blank組各基因的mRNA水平相差無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)，而ISL-1組的竇房結(jié)特異基因HCN4、Cx45和Tbx3的mRNA水平明顯高于mCherry組，工作心肌特異基因Nkx2.5的mRNA水平明顯低于mCherry組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P<0.05)。

圖3 心臟相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

5.起搏離子通道電流的測定：選取細(xì)胞膜光滑、細(xì)胞體飽滿并表達(dá)紅色熒光的的梭形細(xì)胞進(jìn)行檢測(圖4A)。全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示，Blank組和mCherry組均未記錄到超極化激活的內(nèi)向電流，ISL-1組ADSCs可以記錄到超極化激活的內(nèi)向電流(圖4B)，且對Cs+敏感，當(dāng)細(xì)胞外液中加入CsCl(4mmol/L) 阻斷劑后，該內(nèi)向電流被阻斷，當(dāng)細(xì)胞外液中的CsCl被洗脫后，內(nèi)向電流又迅速恢復(fù)，該電流具有明顯的時(shí)間及電壓依賴特性(圖4C)。

圖4 ADSCs膜片鉗記錄

討 論

關(guān)于生物起搏的研究，以前研究者多傾向于研究基因轉(zhuǎn)染，通過導(dǎo)入受損的自律性節(jié)律點(diǎn)或傳導(dǎo)系統(tǒng)的組織中，使目的基因表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)或抑制體內(nèi)某基因的表達(dá)，從而達(dá)到恢復(fù)心臟起搏或傳導(dǎo)功能的目的。隨著干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和分子生物學(xué)的進(jìn)展，研究者后期研究致力于誘導(dǎo)干細(xì)胞生成起搏樣細(xì)胞，移植到受損自律性節(jié)律點(diǎn)或傳導(dǎo)系統(tǒng)組織中，進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)或替代，或?qū)⒏杉?xì)胞作為基因載體與周圍心肌細(xì)胞形成電偶聯(lián)，重建心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)[13]。每種方法都有其局限性：基因治療可能引起基因突變且依賴于基因載體的功能；細(xì)胞治療具有置入部位的免疫抑制和腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)，因此聯(lián)合基因療法和細(xì)胞療法既能結(jié)合彼此的優(yōu)勢又能彌補(bǔ)彼此的缺點(diǎn)，是構(gòu)建生物起搏器的大勢所趨。

間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的方法主要有生化誘導(dǎo)、心肌微環(huán)境誘導(dǎo)和基因修飾3個(gè)方面[14]。其中心肌微環(huán)境主要通過細(xì)胞因子、化學(xué)物質(zhì)、電活性和機(jī)械牽張等方面影響誘導(dǎo)結(jié)果，而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)直接接觸比間接接觸更有利于成體干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，并且以成體干細(xì)胞∶NRVMs=1∶10的比例共培養(yǎng)，更有利于誘導(dǎo)成體干細(xì)胞的分化[15,16]。本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒攜帶在SAN發(fā)育中起上游調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子ISL-1，并與NRVMs共培養(yǎng)模擬心肌生理微環(huán)境共同起到誘導(dǎo)ADSCs向起搏樣細(xì)胞分化的作用。本研究發(fā)現(xiàn)與NRVMs共培養(yǎng)后的ADSCs形態(tài)不規(guī)則，心肌樣偽足明顯增多。超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN)通道共有4種亞型(HCN1～4)表達(dá)，其中HCN4在SAN中表達(dá)量最高并且與SAN的電生理活動緊密相關(guān)，因此HCN4可以被認(rèn)為是SAN的特異性標(biāo)志物[17]。在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ISL-1組細(xì)胞中HCN4的mRNA水平都明顯上調(diào)，并且通過膜片鉗技術(shù)記錄到由HCN通道產(chǎn)生的超極化內(nèi)向離子流(If電流)。心臟中發(fā)現(xiàn)共有4種主要的連接蛋白，包括連接蛋白40(Cx40)、連接蛋白30.2(Cx30.2)、連接蛋白43(Cx43)和連接蛋白45(Cx45)。傳導(dǎo)性強(qiáng)的Cx43在工作心肌細(xì)胞中是主要的連接蛋白，而傳導(dǎo)性較低的Cx45主要在SAN中心表達(dá),竇房結(jié)周圍與界嵴的過渡帶共同表達(dá)Cx43和Cx45[18, 19]。正是縫隙連接蛋白的這種分布特點(diǎn)，使得位于SAN中心的起搏細(xì)胞由于低傳導(dǎo)性的Cx45的保護(hù)而不受心房肌的抑制，最早完成除極成為最早起搏點(diǎn)，并且隨著外圍傳導(dǎo)性逐漸升高，除極電流迅速向外傳播并使心房肌除極，從而保證了SAN正常的起搏功能。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了過表達(dá)ISL-1能促使Cx45顯著上調(diào)。

竇房結(jié)的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，E9.5天可在形態(tài)上鑒別SAN結(jié)構(gòu)，在E12.5天SAN有初步的形態(tài)和功能，約在E14.5天具備典型的SAN結(jié)構(gòu)和動作電位[20]。SAN的胚胎發(fā)育過程中有著眾多轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控，在E8.5天，ISL-1在原始心管的心背系膜及前腸腹側(cè)、心包腔背側(cè)壁臟壁中胚層間充質(zhì)均有表達(dá)，在E9.5天，ISL-1集中表達(dá)在靜脈竇，即早期胚胎的原始起搏區(qū)，數(shù)量隨發(fā)育明顯增加，在E11～12天達(dá)頂峰，在前腸腹側(cè)形成連續(xù)的ISL-1陽性細(xì)胞帶,將流出道遠(yuǎn)端和心房心背系膜相連，E13天后,表達(dá)強(qiáng)度逐漸下降[21]。小鼠竇房結(jié)中的ISL-1陽性細(xì)胞在1～18個(gè)月保持不變，這與在人竇房結(jié)中檢測到ISL-1的mRNA表達(dá)結(jié)果一致[22]。足以可見ISL-1和SAN的胚胎發(fā)育有著明顯的時(shí)空重合，表明ISL-1在SAN的形成過程中起著非常關(guān)鍵的作用。而Tbx3基因主要參與心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控，Wiese等[23]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Tbx3在SAN頭部和尾部均有表達(dá)，啟動起搏基因程序，調(diào)節(jié)起搏細(xì)胞分化形成，對SAN的起搏功能有著重要的作用。并且 Tbx3 可以抑制心房特異性基因如Cx40、Cx43、Nppa 在竇房結(jié)的表達(dá)，維持竇房結(jié)起搏基因HCN4表達(dá)的穩(wěn)定性，確保竇房結(jié)細(xì)胞不向心房肌分化[24]。而Nkx2.5是心肌細(xì)胞表達(dá)的最主要的早期轉(zhuǎn)錄因子之一，主要在工作心肌中表達(dá)，在SAN中不表達(dá)或低表達(dá)。ISL-1和Nkx2.5陽性祖細(xì)胞在心臟分化過程中均呈持續(xù)表達(dá)，Nkx2.5能有助于工作心肌分化，導(dǎo)致HCN4和Tbx3的下調(diào)[21，25]。相反，本實(shí)驗(yàn)證明ISL-1過表達(dá)可上調(diào)SAN特異性基因HCN4和Tbx3，下調(diào)工作心肌基因Nkx2.5，誘導(dǎo)竇房結(jié)分化，表明ISL-1和Nkx2.5是一種相互拮抗的關(guān)系，共同調(diào)控著心臟的胚胎發(fā)育的不同方面。

本研究聯(lián)合生物起搏基因治療和細(xì)胞治療，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將攜帶ISL-1的慢病毒轉(zhuǎn)染至ADSCs，并與NRVMs共培養(yǎng)，誘導(dǎo)ADSCs向起搏樣細(xì)胞分化，成功構(gòu)建了體外生物起搏點(diǎn)。但本研究仍存在以下不足：(1)慢病毒是可以有效整合至宿主染色體的基因載體，但并未進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選和長期觀察。(2)由于慢病毒轉(zhuǎn)染效率低，沒有進(jìn)行下一步的動物實(shí)驗(yàn)。(3)本實(shí)驗(yàn)中相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，推測可能是由于存在物種種屬的差異。筆者將總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，在體內(nèi)和體外進(jìn)行更多的研究，包括在體內(nèi)是否能產(chǎn)生穩(wěn)定的生物起搏器活性，評估其安全性和有效性，尋求更好的穩(wěn)定起博點(diǎn)等。另外，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)具有分化成心室、心房和結(jié)樣細(xì)胞細(xì)胞的巨大潛能并且可避免免疫抑制和腫瘤形成[26]。這些特性使iPSCs與成體干細(xì)胞移植比較，能夠更好地整合到宿主心臟組織中。因此，筆者也正嘗試?yán)胕PSCs構(gòu)建生物起搏點(diǎn)，生物起搏雖然現(xiàn)今取得一定進(jìn)展，但仍需開展深入的實(shí)驗(yàn)研究。