瘦素對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

王 帥 葛俊杰 耿 曉 崔 文 周成軍

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，發(fā)生率近10年顯著增高。甲狀腺乳頭狀癌在甲狀腺癌中最為常見，占80%～85%[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，肥胖是惡性腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)因素。有學(xué)者對(duì)肥胖與甲狀腺癌的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在肥胖人群中甲狀腺癌發(fā)生率更高[2]。并有研究報(bào)道血清瘦素水平與體重呈正相關(guān)[3]。瘦素是研究最多的脂肪因子之一，是由肥胖基因(ob)編碼的蛋白類激素?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存來調(diào)節(jié)體重，并且對(duì)于食物攝取與能量平衡、新陳代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌也有調(diào)節(jié)作用[4]。本研究對(duì)瘦素與人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究瘦素對(duì)K1細(xì)胞功能的調(diào)控。

材料與方法

1.材料 ：人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系(K1)購于歐洲細(xì)胞庫(英國ECACC公司)。DMEM培養(yǎng)基購自中國Fisher公司，胎牛血清(FCS)購自杭州四季青公司，MTT購自美國Sigma公司，Transwell小室購自美國Costar公司。

2.方法：(1)細(xì)胞培養(yǎng)使用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合至80%時(shí)，1∶2傳代。(2)MTT實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長期的K1細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中。接種第2天換DMEM無血清培養(yǎng)液，每孔加入100μl。第3天同一時(shí)間，配置好不同濃度的瘦素，實(shí)驗(yàn)設(shè)置0ng/ml(空白對(duì)照組)、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、125ng/ml 5個(gè)組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別在加藥后的24h和48h加入25μl MTT溶液，2h后加入100μl Lysis buffer溶液，過夜(超過12h)后測(cè)吸光度值(波長為570nm)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。(3)劃痕實(shí)驗(yàn):將K1細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中。第2天長滿后用200μl的槍頭比對(duì)直尺垂直劃痕。每孔劃痕3道垂直線。劃痕后使用PBS沖洗細(xì)胞2次。用配制好的不同濃度瘦素給予刺激(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、125ng/ml)。分別在0、24和48h置于熒光倒置顯微鏡下拍照。計(jì)算得出細(xì)胞遷移率[細(xì)胞遷移率(%)=(修復(fù)前劃痕內(nèi)面面積-修復(fù)后劃痕內(nèi)面面積)/修復(fù)前劃痕內(nèi)面面積×100%]。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。(4)Transwell實(shí)驗(yàn):用30μl 1∶6稀釋的Matrigel膠鋪于Transwell小室上層，2h后加100μl DMEM培養(yǎng)基水化，上室加入用不同濃度瘦素預(yù)先處理過的細(xì)胞2×105個(gè)，下室加入500μl含10%FBS的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。72h后取出小室，PBS清洗3遍，棉簽輕輕擦去上室內(nèi)細(xì)胞，無水甲醇固定30min，0.5%的結(jié)晶紫染色30min，PBS清洗3次，自然風(fēng)干，每個(gè)濃度組在正置顯微鏡下取5個(gè)視野拍照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

結(jié) 果

1.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)K1細(xì)胞增殖：5組不同濃度瘦素處理K1細(xì)胞后，用MTT法連續(xù)觀察K1細(xì)胞在24h和48h增殖情況，檢測(cè)波長570nm處的吸光度(A)值，運(yùn)用ANOVA法計(jì)算出數(shù)據(jù)(表1)。結(jié)果顯示相同時(shí)間下不同波度組的瘦素對(duì)K1細(xì)胞的增殖并無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同濃度瘦素影響K1細(xì)胞增殖

2.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)K1細(xì)胞遷移：0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和125ng/ml不同濃度瘦素組24h K1細(xì)胞遷移率分別為40.201%、47.383%、59.950%、68.732%、79.306%；48h細(xì)胞遷移率分別為49.398%、74.192%、86.733%、87.795%、90.005%。隨著瘦素濃度逐漸升高，劃痕內(nèi)面面積縮小，遷移率升高；隨著瘦素處理時(shí)間延長，劃痕內(nèi)面面積縮小，遷移率升高。K1細(xì)胞表現(xiàn)出與瘦素的時(shí)間依賴性與濃度依賴性的特點(diǎn)。24h與48h遷移率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各濃度瘦素處理K1細(xì)胞后遷移率分析(%)

3.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)K1細(xì)胞侵襲：顯微鏡下計(jì)數(shù)0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和125ng/ml 5個(gè)濃度組的K1細(xì)胞穿出聚碳酸酯膜個(gè)數(shù)分別為63±3、97±7、126±6、140±1、180±2個(gè)(圖2)。穿出聚碳酸酯膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)與瘦素濃度呈正比。隨著瘦素濃度增加，K1細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，說明瘦素對(duì)K1細(xì)胞侵襲能力有促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

圖1 各濃度瘦素處理K1細(xì)胞后劃痕實(shí)驗(yàn)圖片(×100，熒光倒置顯微鏡)

圖2 不同濃度瘦素處理K1細(xì)胞侵襲性比較(結(jié)晶紫染色，×100)A.0ng/ml;B.10ng/ml;C.50ng/ml;D.100ng/ml;E.125ng/ml

甲狀腺癌是目前增長最快的惡性腫瘤，排名第6位[5, 6]。甲狀腺癌有4種分型，即甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、濾泡型甲狀腺癌(FTC)、低分化癌(PDTC)和未分化癌(ATC)。2014年美國診斷病例為62980例，其中90%為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[7]。未分化的甲狀腺癌由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和缺乏有效治療，10年生存率<10%[8]。隨著多種診斷技術(shù)和診斷方法的增加，甲狀腺癌的檢出率也逐漸增高，甲狀腺癌早期多無明顯癥狀，多在健康體檢中發(fā)現(xiàn)有占位性病變。另外CT、MRI掃描、生化標(biāo)志物等多種診斷技術(shù)的使用增多也使甲狀腺癌的檢出率增高[9]。

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，肥胖已經(jīng)成為全球性疾病，并且與許多疾病息息相關(guān)，也是致癌的危險(xiǎn)因素之一。脂肪組織不僅可以儲(chǔ)存能量，還能分泌細(xì)胞因子和激素，如脂聯(lián)素(adiponectin)、瘦素(leptin)、內(nèi)臟脂肪素(visfatin)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。雖然與肥胖發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制尚未完全明確，但是基因起到?jīng)Q定性因素，最主要的基因是肥胖(Ob)基因和Ob受體(Ob-R)基因。瘦素與其受體結(jié)合后激活PI3K、ERK1/2、STAT3條通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，并且當(dāng)瘦素受體相對(duì)缺乏時(shí)，可影響ERK1/2和(JAK2)/ STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10，11]。

瘦素是由Ob基因編碼的由167個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)入血后去除N末端的21個(gè)氨基酸信號(hào)序列后，形成含有146個(gè)氨基酸的蛋白類激素[12]。大多數(shù)瘦素主要分布在白色脂肪，血循環(huán)中瘦素濃度測(cè)定直接與人體白色脂肪的總量呈正比。健康人群中瘦素的含量是5～10ng/ml,肥胖人群中瘦素含量是40～100ng/ml[13]。

Rehem等[14]研究了高分化甲狀腺癌與血清瘦素的關(guān)系，采集30例高分化甲狀腺癌患者與30例甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者術(shù)前和術(shù)后1個(gè)月的血樣，分析血清瘦素的變化，得出血清瘦素水平比對(duì)照組高且術(shù)后下降，這一現(xiàn)象說明瘦素在診斷甲狀腺癌中起到重要作用。Hedayati等[15]選取83例甲狀腺乳頭狀癌PTC患者(35例男性、48例女性)和90名健康者(40名男性、50名女性)，年齡、性別、BMI均互相匹配。采集血樣測(cè)定血清瘦素后比較含量，并測(cè)量身高、體重、計(jì)算BMI。實(shí)驗(yàn)分析患病組比正常組血清瘦素水平高，說明瘦素與PTC有相關(guān)性；女性比男性瘦素水平高，說明體內(nèi)的脂肪含量與瘦素水平呈正比(女性體內(nèi)脂肪含量高于男性)。Fan等[16]探討了瘦素及其受體在甲狀腺癌預(yù)后中的潛在意義，選取173例甲狀腺癌患者，得出瘦素及其受體的表達(dá)與PTC有相關(guān)性，并且會(huì)引起患者預(yù)后不良。

本實(shí)驗(yàn)選取了脂肪因子中的瘦素進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示瘦素并不影響細(xì)胞的增殖(P>0.05)。體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞能夠大量增殖可能與癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這一特性有關(guān)，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的大量增殖[17]。在本實(shí)驗(yàn)中癌細(xì)胞增殖不受影響，或許是因?yàn)榧?xì)胞模型的局限性所致。另外的一個(gè)原因或許是因?yàn)槭菟氐挚宫F(xiàn)象，即瘦素受體具有飽和性，從而導(dǎo)致濃度過高的瘦素因?yàn)槭菟厥荏w的這一特性不能完全發(fā)揮作用。也或許是瘦素僅僅是在患癌的起始階段起了一定的作用，體內(nèi)過高濃度的瘦素只起到致癌的作用，而并不能促進(jìn)癌細(xì)胞生長。中國臺(tái)北地區(qū)Mackay Memorial醫(yī)院的Cheng等[17]研究了瘦素對(duì)K1細(xì)胞的遷移能力，研究發(fā)現(xiàn)高濃度瘦素能夠提高其遷移性[17]。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的瘦素處理K1細(xì)胞后劃痕實(shí)驗(yàn)也得出瘦素能夠促進(jìn)K1細(xì)胞的遷移。腫瘤細(xì)胞穿過基膜是腫瘤細(xì)胞是否轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵一步，建立體外侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)侵襲的生理過程，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示瘦素促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲，并且隨瘦素濃度的增加侵襲性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)初步探討了瘦素對(duì)于甲狀腺癌侵襲的影響，機(jī)制還尚不完全清楚，在下一步實(shí)驗(yàn)中還需進(jìn)一步研究哪個(gè)信號(hào)通路在這一過程中起作用。

綜上所述，對(duì)甲狀腺癌的診斷除其他的特定腫瘤標(biāo)志物外，瘦素還可作為一個(gè)相關(guān)肽輔助診斷。在臨床甲狀腺癌治療中，瘦素或許可以作為一個(gè)基因治療的靶點(diǎn)或是一種新藥起到臨床治療作用。