腦脊液谷胱甘肽氧化酶在阿爾茨海默病中的診斷價值

劉辰庚 孟 雙 高 原 關(guān)小童 張齊皓 朱繼開 許清源 王培昌

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一類重要的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，其臨床表現(xiàn)主要為認(rèn)知功能、記憶能力、語言表達和行為方式等的漸進性、持續(xù)性退化[1]。目前AD的早期診斷大都依賴精神量表評分、臨床癥狀和影像學(xué)指標(biāo)等，但能常規(guī)用于臨床AD診斷的檢驗醫(yī)學(xué)生物標(biāo)志物較少[2～5]。筆者所在科室前期研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦脊液(cerebro-spinal fluid，CSF)酶譜可能有助于其診治,本研究擬初步探索其中的損傷性酶學(xué)標(biāo)志物：肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，以及氧化還原酶學(xué)和肽類標(biāo)志物：谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、還原性谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和氧化性谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)等在AD早期診斷和分期中的潛在價值。

材料與方法

1.臨床資料：隨機選取2017年10月～2018年3月就診于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院的AD受試者共235例，其中輕度認(rèn)知障礙期受試者(mild cognitive impairment，MCI)100例(男性43例，患者平均年齡65.0±4.5歲；女性57例，患者平均年齡67.0±4.7歲)；癡呆期受試者(dementia of the Alzheimer type，DAT)135例(男性69例，平均年齡72.0±5.0歲；女性66例，平均年齡74.0±4.5歲)。MCI和DAT的診斷符合我國神經(jīng)內(nèi)科學(xué)會推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6, 7]。分別針對MCI和DAT組隨機選取健康對照組受試者各30例(MCI對照組：男性14例，患者平均年齡65.0±4.5歲；女性16例，患者平均年齡67.0±4.7歲。DAT對照組：男性15例，患者平均年齡69.0±5.0歲；女性15例，患者平均年齡72.0±4.5歲)。另隨機選取血管性癡呆(vascular dementia，VD)患者30例作為疾病對照組(男性15例，平均年齡59.0±4.5歲；女性15例，平均年齡64.0±4.6歲)。生物參考區(qū)間建立使用隨機選取的健康受試者(包含以上的表面健康對照組受試者)120例，男女性別各半，年齡31～80歲，平均年齡55.0±4.6歲。本研究內(nèi)容已經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)。

2.標(biāo)本留?。菏茉囌哂谏衔缬膳R床醫(yī)生抽取CSF，抽取后的樣本于1h內(nèi)送至實驗室，CSF常規(guī)結(jié)果顯示紅細胞陽性的標(biāo)本棄用，CSF經(jīng)4000×g離心5min后取上清置于-80℃冰箱備用，標(biāo)本只允許凍融1次。

3.損傷性酶學(xué)標(biāo)志物檢測：使用日本日立7600型全自動生化分析儀檢測CK和LDH。CK檢測使用北京中生公司試劑，LDH檢測使用北京柏定公司試劑，檢測參數(shù)為筆者所在科室研發(fā)的CSF檢測專用參數(shù)；測定時儀器處于正常的鑒定、保養(yǎng)、定標(biāo)和室內(nèi)質(zhì)控狀態(tài)。

4.氧化還原酶學(xué)標(biāo)志物檢測：使用分光光度法檢測GPx、GR、GSH和GSSG；試劑由上海碧云天公司提供；儀器為上海思龍722s型分光光度計；所有檢測操作均嚴(yán)格按照說明書進行。

5.生物參考區(qū)間的初步建立：使用表面健康受試者的95% CI計算各指標(biāo)的生物參考區(qū)間，比較它們在早期AD診斷和分期中的價值。

6.統(tǒng)計學(xué)方法：使用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和受試者工作曲線分析(receiver operating characteristic curve，ROC)。非正態(tài)分布計量資料的組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗進行組間檢測結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析；率的比較使用χ2檢驗；組間比較使用單因素方差分析(one-wayANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.損傷性酶學(xué)標(biāo)志物檢測結(jié)果：MCI受試者CSF的CK和LDH略高于健康對照組和血管性癡呆組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)；DAT受試者CSF的CK顯著高于MCI組、正常對照組和血管性癡呆組(P<0.05，表1)。

表1 損傷性酶學(xué)標(biāo)志物檢測結(jié)果

與對照組比較，*P<0.05；與血管性癡呆組比較，#P<0.05；與MCI組比較，ΔP<0.05

2.氧化還原酶學(xué)標(biāo)志物檢測結(jié)果：MCI受試者CSF的GR水平顯著低于健康對照組和血管性癡呆組(P<0.05)，其GPx和GSH略低于健康對照組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DAT患者的GR水平顯著低于健康對照組、血管性癡呆組和MCI組(P<0.05)，其GPx和GSH顯著低于健康對照組、血管性癡呆組和MCI組(P<0.05,表2)。

表2 氧化還原酶學(xué)標(biāo)志物檢測結(jié)果

3.診斷效能比較：使用健康受試者測定值計算的各指標(biāo)95%生物參考區(qū)間和使用ROC曲線分析得出的MCI和DAT患者的診斷界值、敏感度和特異性見表3，各項目的生物參考區(qū)間上限均低于ROC曲線確定的截斷值。CK和GR在MCI和DAT的診斷和鑒別診斷中具有較高的敏感度和特異性(P<0.05)。

表3 各指標(biāo)的生物參考區(qū)間和ROC曲線分析各指標(biāo)對MCI及DAT的診斷效能

討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計，全世界目前約有3500萬AD患者。隨著我國人口老齡化的不斷演進，近年來AD的患病人數(shù)呈不斷增長的態(tài)勢[7～9]。研究表明，在患者出現(xiàn)典型的AD臨床癥狀之前的10～20年，其腦組織中已存在了AD相關(guān)的病理生理改變，且持續(xù)至發(fā)病[10～12]。但對于已經(jīng)確診的癡呆期AD患者(DAT)而言，目前尚缺乏有效的治療手段[13, 14]。而對于MCI和MCI前期等早期AD患者則可通過藥物干預(yù)和生物物理治療等手段有效緩解疾病的進展。故在當(dāng)前階段，對其AD進行有效的早期診斷和病程監(jiān)控更為關(guān)鍵[15, 16]。

目前可用于AD診斷的生物標(biāo)志物主要有核酸類和蛋白類兩種，核酸類標(biāo)志物主要集中在易感基因分析和microRNA等小分子核酸檢測方面，蛋白類標(biāo)志物主要包括tau蛋白和Aβ等AD關(guān)鍵蛋白的檢測方面[17]。上述標(biāo)志物主要存在檢測方法復(fù)雜、不適于早期診斷、檢測周期長、結(jié)果不穩(wěn)定等問題。而酶學(xué)標(biāo)志物的檢測方法成熟，檢測速度快，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，故在多種疾病的診斷中有廣泛的應(yīng)用[18]。本研究結(jié)合前期研究，檢測了不同階段AD患者CSF內(nèi)的酶類標(biāo)志物。CK和LDH主要作為損傷性標(biāo)志物反應(yīng)腦組織損傷的情況。CK在腦組織中主要以腦性同工酶(CK-BB)的形式存在，在血腦屏障未受損的情況下，CK的測定值主要反應(yīng)CK-BB的活性；LDH在腦中也有表達，但顯著低于外周血中的含量，其與CK類似，也主要反應(yīng)腦細胞受損的情況。在AD患者腦組織中，神經(jīng)元細胞損傷、壞死和凋亡的情況較為多見，本研究的結(jié)果顯示，DAT患者CSF腦脊液的LDH和CK活性顯著升高，而MCI患者則無此現(xiàn)象，提示CSF LDH和CK活性檢測可作為AD分期的潛在標(biāo)志物。

谷胱甘肽廣泛存在于動植物體內(nèi)，是生物體內(nèi)最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種存在形式，它們與GPx和GR一起構(gòu)成了重要的氧化還原的控制、調(diào)節(jié)系統(tǒng)。已有研究表明，氧化應(yīng)激在AD患者的發(fā)病和病程演進中扮演了重要角色，其在細胞自噬、凋亡、基因和蛋白的穩(wěn)定性等環(huán)節(jié)均可調(diào)節(jié)組織細胞的功能狀態(tài)，高氧化應(yīng)激狀態(tài)對細胞具有諸多負(fù)面影響[19, 20]。本研究納入的患者均為經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科以美國國立老化研究所與阿爾茨海默病協(xié)會診斷指南為標(biāo)準(zhǔn)診斷的不同階段AD確診病例，故上述損傷性酶學(xué)指標(biāo)和氧化應(yīng)激酶學(xué)指標(biāo)的改變具有一定的代表性；結(jié)果表明，AD患者CSF中GPx、GR和GSH等代表抗氧化能力的標(biāo)志物呈下降趨勢，而GSSG等代表氧化應(yīng)激的標(biāo)志物呈上升趨勢，反應(yīng)氧化狀態(tài)的GSH/GSSG比值呈下降趨勢，提示通過檢測CSF中的上述氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)可能從一個側(cè)面提示腦組織中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，以評估患者的疾病進展階段和預(yù)后。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，AD患者CSF中的LDH和CK等損傷性酶學(xué)標(biāo)志物及GPx和GR等氧化還原酶學(xué)標(biāo)志物在AD的早期診斷和分期中具有一定價值；以CK和GR的截斷值診斷上述疾病具有較好的敏感度和特異性。