主動(dòng)脈夾層中層P53、MDM2及TRIM25的表達(dá)變化和VSMC表型轉(zhuǎn)化

任 偉 王志維 李博文 昌金星 王嘉慧

主動(dòng)脈夾層(aortic dissection，AD)是心血管外科的常見(jiàn)的災(zāi)難性疾病之一，其發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，目前認(rèn)為主動(dòng)脈中層平滑肌的退行性病變、炎癥、力學(xué)沖擊三者參與夾層的發(fā)生，平滑肌收縮對(duì)血流力學(xué)沖擊的拮抗是血管的穩(wěn)態(tài)之一，一旦損傷容易誘發(fā)夾層。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的表型轉(zhuǎn)化是主動(dòng)脈中層退行性變的主要特征，但是其轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制仍未闡明[1～3]。三基序蛋白25(tripartite-motif protein25, TRIM25)能夠通過(guò)泛素化參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞周期調(diào)控和轉(zhuǎn)錄，主要在子宮、胚胎及主動(dòng)脈組織中表達(dá)[4,5]。本研究通過(guò)對(duì)正常主動(dòng)脈組織和夾層主動(dòng)脈中層中TRIM25、P53、MDM2表達(dá)量變化和VSMC表型變化的研究，探討其在AD形成過(guò)程的作用及可能機(jī)制。

材料與方法

1.一般資料：選取2015年1月～2016年1月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院行全弓替換手術(shù)患者12例作為AD組。納入標(biāo)準(zhǔn)：主動(dòng)脈CTA明確診斷為A型主動(dòng)脈夾層，發(fā)病1周以內(nèi)；排除標(biāo)準(zhǔn)：馬方綜合征和特納綜合征等結(jié)締組織疾病，合并二葉式主動(dòng)脈瓣畸形或胸部損傷，再次心臟手術(shù)者和CTA或術(shù)中發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的主動(dòng)脈壁粥樣硬化。正常對(duì)照組的患者來(lái)自于心臟死亡捐獻(xiàn)者，無(wú)主動(dòng)脈疾病史，其他排除標(biāo)準(zhǔn)同上。術(shù)前資料總結(jié)發(fā)現(xiàn)兩組患者年齡性別和體重?zé)o明顯差異，AD組合并高血壓者明顯高于正常組，詳見(jiàn)表1。術(shù)前簽署知情同意書(shū)，并獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 AD組和正常對(duì)照組的基本特征

主要試劑骨橋蛋白(OPN)和(平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)兔單克隆抗體購(gòu)于北京博奧森公司，P53和p-P53(Ser15) 鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，MDM2兔抗人單克隆抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，TRIM25兔抗人單克隆抗體購(gòu)于武漢三鷹公司，抗鼠/兔二抗購(gòu)于美國(guó)Licor公司。

2.免疫組化染色:獲取升主動(dòng)脈組織后去除主動(dòng)脈外膜和內(nèi)膜，保留中層組織，固定后石蠟包埋，4μm厚切片。石蠟切片二甲苯脫蠟 2 次，梯度乙醇水化，微波修復(fù)抗原10min，3%雙氧水孵育15min 以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗后5%山羊血清封閉，分別加入鼠抗人α-SMA、OPN、P53、TRIM25、MDM2一抗，稀釋比例為1∶100，HRP標(biāo)記的抗鼠二抗37℃孵育30min；各步驟用PBS洗3min×3次，DAB顯色劑，蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明后封片。在顯微鏡下觀察陽(yáng)性染色區(qū)域?yàn)樽攸S色或棕褐色顆粒；采用Image-Pro Plus 6圖像分析軟件(美國(guó)Media Cybernetics公司)對(duì)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行計(jì)量分析。從每張切片中連續(xù)手動(dòng)隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(×200倍)。分別對(duì)切片免疫組織化學(xué)染色的陽(yáng)性區(qū)域、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析，計(jì)算每視野陽(yáng)性染色的積分吸光度(IOD)值，并取積分吸光度之和。

3.Western blot法實(shí)驗(yàn)：將取得的組織在1～2ml勻漿皿中于4℃ 生理鹽水中洗凈、稱量、研磨，加用400μl單去污劑裂解液PMSF，裂解30min后在4℃下12000r/min離心5min，取上清于0.5ml EP管，取少量蛋白提取液，使用PerkinElmer酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白含量(波長(zhǎng)560nm)，標(biāo)本儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩⒌鞍踪|(zhì)樣品液與上樣緩沖液混合，煮沸5min，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)法(北京六一公司)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗GAPDH(1∶1000)，α-SMA、OPN、P53、MDM2、TRIM25、p-P53(1∶500)。4℃過(guò)夜，加帶顯色劑的抗鼠二抗，室溫震動(dòng)下孵育2h，TBST避光洗滌(5min×3次)后直接奧德賽掃膜儀(美國(guó)Licor公司)上掃膜，再對(duì)條帶進(jìn)行背景調(diào)節(jié)和灰度值測(cè)定并分析。

4.RT-PCR檢測(cè):稱取200mg超低溫凍存的主動(dòng)脈中層組織使用液氮碾磨法碾磨成粉末，加入1ml Trizol溶液充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管中，室溫靜置5min，向上述勻漿裂解液中加入1/5體積氯仿，充分混合至乳白色，室溫靜置5min，12000×g離心力 4℃離心15min，取上層無(wú)色上清液至另一EP管中，向上清液中加入0.5～1.0倍體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻后室溫靜置10min，12000×g離心力 4℃離心10min，棄上清，加入與Trizol等體積的75%乙醇，輕輕顛倒洗滌，7500×g離心力 4℃離心5min后棄去上清，倒扣EP管干燥沉淀后，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的 純度和濃度。按照日本TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)(RR047A)，反應(yīng)分兩步，步驟一：取一PCR管，分別加入5×gDNA Eraser Buffer 2μl、gDNA Eraser 1μl、Total RNA 1μg，然后用RNase Free dH2O補(bǔ)足至10μl，于PCR儀上42℃保溫2min，迅速置冰上冷卻；步驟二：提前配制Master Mix，將步驟一的10μl反應(yīng)液與Master Mix 10μl混勻后于PCR儀上按照37℃ 15min→85℃ 5s→4℃∞設(shè)定程序進(jìn)行反應(yīng)，上述所有反轉(zhuǎn)錄程序均為1個(gè)循環(huán)。反轉(zhuǎn)錄完成后按照TaKaRa公司RT-PCR試劑盒(RR820A)進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系如下(總體積20μl)：SYBR Premix Ex Taq 10μl+PCR Forward Primer (10μmol/L) 0.8μl+PCR Reverse Primer (10μmol/L) 0.8μl + ROX Reference Dye Ⅱ0.4μl+DNA模板2μl+dH2O 6μl；擴(kuò)增程序如下：Stage 1(1 Reps): 95℃ 30s→Stage 2 (40 Reps): 95℃ 5s→60℃ 34s→Dissociation。所有引物均在上海生物工程股份有限公司合成，各基因引物序列如下：P53上游引物：5′-AGGTTGGCTCTGACTGTACC-3′，下游引物：5′-GATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3′；MDM2上游引物：5′-CAGGCAGGGGAGAGTGATA-3′，下游引物：5′-GTGATGGAAGGGGGGGATT-3′；TRIM25上游引物：5′-AATACACGGAAATGAAGGCT-3′，下游引物：5′-AACTCATCCCTCTTGGTCAG-3′；β-actin 上游引物：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。

結(jié) 果

1.免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞變化:主動(dòng)脈中層的主要細(xì)胞成分就是平滑肌細(xì)胞，免疫組化證實(shí)獲取組織主要細(xì)胞成分是α-SMA陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞。已有研究表明VSMC由分化型轉(zhuǎn)變成未分化型會(huì)導(dǎo)致SMC收縮功能減弱，而這有可能導(dǎo)致主動(dòng)脈中層組織薄弱。在本實(shí)驗(yàn)中，分別檢測(cè)主動(dòng)脈中層分化型VSMC表型標(biāo)志物α-SMA和未分化型表型標(biāo)志物OPN。通過(guò)免疫組化染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，在AD組血管中層的α-SMA含量顯著降低而OPN含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1，表2)。

圖1 兩組主動(dòng)脈α-SMA和OPN表達(dá)免疫組化(×200)與正常對(duì)照組比較，*P<0.01

表2 主動(dòng)脈α-SMA和OPN免疫組化IOD值

2.免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈中層P53、MDM2和TRIM25含量變化：通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AD組中層的P53、MDM2和TRIM25含量與正常對(duì)照組比較顯著增多，而p-P53蛋白表達(dá)量下降比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖2，表3)。

圖2 AD組和正常對(duì)照組主動(dòng)脈中層(免疫組化,×200)與正常對(duì)照組比較，*P<0.01

表3 P53、MDM2、TRIM25和p-P53 IOD值

3.Western blot法檢測(cè)主動(dòng)脈中層蛋白表達(dá)：與正常對(duì)照組比較，α-SMA和p-P53在AD患者主動(dòng)脈組織內(nèi)表達(dá)顯著降低(P<0.01),而在AD患者主動(dòng)脈組織中OPN、P53、MDM2、TRIM25蛋白水平卻顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表4，圖3)。

4.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果:進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了P53、MDM2和TRIM25的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)夾層組中P53、MDM2和TRIM25的mRNA表達(dá)量也增加(P<0.01,表5，圖4)。

表4 AD組和正常對(duì)照組相關(guān)蛋白表達(dá)水平

圖3 Western blot法檢測(cè)結(jié)果A.MDM2;B.TRIM25和P53;C.α-SMA、OPN和p-P53；與正常對(duì)照組比較，*P<0.01

mRNA正常對(duì)照組(n=12)AD組(n=12)P531.000±0.0002.235±0.203?MDM21.000±0.0001.697±0.203?TRIM251.000±0.0001.794±0.191?

與正常對(duì)照組比較，*P<0.01

討 論

AD的典型組織學(xué)特征是中層退行性變，目前對(duì)主動(dòng)脈中層退行性變的分子機(jī)制正被廣泛研究，但尚未闡明[6]。大量研究顯示微纖維、膠原、蛋白聚糖和黏多糖、血管VSMC等主動(dòng)脈壁的組成結(jié)構(gòu)和功能異常是AD發(fā)生的病理基礎(chǔ)。而VSMC的表型轉(zhuǎn)化和凋亡在AD發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，其受多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)包括MAPK、PI3K和cAMP等[7,8]。最近發(fā)現(xiàn)P53 是 VSMC 分化的強(qiáng)誘導(dǎo)因子，P53 導(dǎo)致VSMC由去分化型向分化型轉(zhuǎn)化，分化型VSMC可以維持血管彈性和收縮血管，不易導(dǎo)致主動(dòng)脈中層退行性變[9]。Leeper等也發(fā)現(xiàn)，CDKN2B缺失的情況下，P53 表達(dá)上調(diào)，動(dòng)物模型主動(dòng)脈瘤形成。在本實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)AD組中P53含量明顯增多，α-SMA含量減少，說(shuō)明AD中VSMC由分化型向去分化型轉(zhuǎn)變。但這違背了 P53 作為VSMC 分化誘導(dǎo)因子的功能。

圖4 兩組P53、MDM2、TRIM25 mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較，*P<0.01

P53下游轉(zhuǎn)錄激活產(chǎn)物之一是MDM2，它可以通過(guò)與P53結(jié)合形成復(fù)合物，維持低水平的P53蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制P53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，這個(gè)P53/MDM2反饋回路也是保持機(jī)體生理功能的重要機(jī)制之一。 如果出現(xiàn)了各種刺激因素包括低氧、DNA損傷和核苷酸缺失等情況會(huì)導(dǎo)致P53蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性迅速增加，從而激活下游的靶基因MDM2。當(dāng)DNA修復(fù)后，負(fù)調(diào)節(jié)因子MDM2開(kāi)始反饋抑制P53，從而防止P53的進(jìn)一步作用[10,11]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)AD組的MDM2含量較正常組顯著增加。在AD組主動(dòng)脈中層組織中，Western blot法檢測(cè)MDM2的蛋白含量增加，并且通過(guò) RT-PCR檢測(cè)筆者發(fā)現(xiàn)MDM2的mRNA含量較對(duì)照組增加數(shù)倍。所以，筆者推測(cè)在AD發(fā)病過(guò)程中，MDM2和P53的負(fù)反饋平衡被打亂：增加的P53促進(jìn)MDM2的mRNA表達(dá)量增加，使 MDM2的mRNA表達(dá)量增多進(jìn)而增加MDM2的蛋白含量，但是增加的MDM2蛋白不能降解P53蛋白，導(dǎo)致P53蛋白的穩(wěn)定性增加并致使P53在AD中層組織中聚集。

MDM2可通過(guò)多種分子機(jī)制參與對(duì)P53的反饋抑制，包括：①P53的活性由多種因素決定，激活的P53在細(xì)胞核內(nèi)激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄，其降解在胞質(zhì)中進(jìn)行。核輸出序列(NES)和核定位序列(NLS)是MDM2具有核質(zhì)穿梭能力的重要標(biāo)志，亞細(xì)胞定位對(duì)于其抑制P53轉(zhuǎn)錄活性非常重要。如果P53在高表達(dá)狀態(tài)，細(xì)胞核中的P53可以被MDM2直接降解。如果P53在低表達(dá)狀態(tài)時(shí)，其轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)可以被具有MDM2突變的NES結(jié)合，從而抑制P53活性； ②MDM2的N端具有疏水和芳香氨基酸形成的深溝，P53作為轉(zhuǎn)錄因子TFIID的組成部分與MDM2結(jié)合后抑制了其轉(zhuǎn)錄激活靶基因的能力; ③P53蛋白的特異性E3連接酶就是MDM2，其可以使P53蛋白和泛素相連接后泛素化P53，再被蛋白酶在細(xì)胞質(zhì)中降解[12,13]。

而TRIM25作為一種泛素化E3連接酶，主要表達(dá)在胚胎、子宮、甲狀腺、主動(dòng)脈和脾臟中表達(dá)，很少在其他組織中表達(dá)。有研究報(bào)道，在經(jīng)雌激素治療過(guò)的乳腺癌患者中可檢測(cè)到高水平的TRIM25、P53和MDM2的表達(dá)[14]。而本研究發(fā)現(xiàn)夾層組的TRIM-25蛋白和mRNA水平的表達(dá)量均顯著增加。因而筆者推測(cè)可能由于夾層中TRIM-25的表達(dá)量增加競(jìng)爭(zhēng)性抑制MDM2與P53的泛素化降解從而增加P53含量。但是P53的活性受到抑制，從而不能誘導(dǎo)VSMC分化，通過(guò)Western blot法檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)夾層組P53的磷酸化水平降低。

綜上所述，AD主動(dòng)脈中層中P53、MDM2及TRIM 25表達(dá)量均顯著增加，主動(dòng)脈中層中VSMC表型向去分化型轉(zhuǎn)變，可能是由于P53/MDM2反饋環(huán)平衡被TRIM25打亂所致。但是P53、MDM2及TRIM25在主動(dòng)脈中層組織中的增多究竟是AD發(fā)病之前的誘因或者是其發(fā)病之后的結(jié)果，同時(shí)高血壓對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的影響如何？這需要進(jìn)一步在體外細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證TRIM-25的過(guò)表達(dá)是否會(huì)導(dǎo)致MDM2和P53結(jié)合障礙從而引起其含量增加，導(dǎo)致VSMC表型和功能發(fā)生變化。