可吸收形狀記憶套管用于大鼠腹主動(dòng)脈無縫線吻合的實(shí)驗(yàn)研究

羅廷澤 邱 超 夏 琰 程曉松 張 波 許碩貴

中小血管吻合技術(shù)涉及手足外科、頭頸外科、頜面外科、整形外科、血管外科，是斷肢(指、趾)再植、離斷血管修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)、更是游離組織瓣修復(fù)重建成敗的決定技術(shù)。一直以來，為了能夠?qū)ふ业揭环N吻合速度迅速、吻合通暢率良好、且能滿足血管生理與生物力學(xué)要求的理想方法，研究者進(jìn)行了很多嘗試，但迄今尚未取得突破性進(jìn)展[1]。小血管吻合口失敗研究者主要原因是吻合口的狹窄，而吻合口狹窄的主要原因是血管壁對其損傷的反應(yīng)性重構(gòu)及內(nèi)膜增生(vascular intimal hyperplasia, VIH)[2,3]。為防止血管吻合后再狹窄，許多研究者進(jìn)行了微小血管無縫線吻合法的研究，無縫線吻合法避免了針線對血管壁的全層針刺損傷和縫線拖拉損傷，可以從根源上解決微小血管吻合后再狹窄的問題。但目前報(bào)道的各類無縫線吻合法都有各自的不足之處。為此本課題組發(fā)明了一種可吸收形狀記憶套管材料用于微小血管的無縫線吻合，并進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

可吸收形狀記憶套管材料為課題組發(fā)明(圖1，直徑5mm)，主要成分為聚己內(nèi)酯，為美國FDA批準(zhǔn)臨床使用材料，添加的輔料偶聯(lián)劑為烴氧基硅烷[4，5]。多官能團(tuán)單體選自含2～3個(gè)烯鍵的有機(jī)酯，如季戊四醇三烯酸酯等。填料選自含有活性鈣離子的化合物，如磷酸氫鈣等，均為生物相容性良好，且可吸收的材料。利用放射性交聯(lián)技術(shù)制備的形狀記憶套管用溫生理鹽水(50℃)加熱后可收縮至原來形狀(直徑1.2～2.5mm)。

圖1 可吸收形狀記憶套管

材料與方法

1.血管吻合動(dòng)物模型的建立:以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，分別建立實(shí)驗(yàn)組(可吸收形狀記憶套管系統(tǒng)組)和對照組(傳統(tǒng)縫線組)動(dòng)物模型，每組分別行端-端吻合。(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量：300～350g，由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(滬)2017-0004。(2)微血管吻合術(shù)：用1%利多卡因經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后，腹部備皮后碘伏消毒術(shù)區(qū)2次，在外科顯微鏡下通過腹部正中切口分離主動(dòng)脈(每組30個(gè))，以1%的利多卡因沖洗術(shù)野防止血管痙攣，夾閉動(dòng)脈，切斷，并用含肝素的鹽水沖洗動(dòng)脈。(3)實(shí)驗(yàn)組行可吸收形狀記憶套管配合醫(yī)用Histoacry?組織膠水吻合：①用形狀記憶套管材料(直徑5mm，長度4mm)套于近端斷裂血管外面，套管的一邊對齊近心端血管斷裂口，將一根直徑適宜的克氏針的鈍性端插入近端心血管腔內(nèi)4～6mm，暫時(shí)性支撐血管防止血管壁塌陷，用少量溫生理鹽水(50℃)加溫，形狀記憶套管回縮至原直徑形狀(原直徑接近血管腔直徑1.2～1.6mm)，套管此時(shí)貼近血管外壁，并具有一定的韌性從而為提供血管壁支撐力，用Histoacry?組織膠水將套管與血管外壁粘合，取走血管腔內(nèi)克氏針，套管材料可支撐近心端斷裂口處血管腔；②采用上述同樣方法準(zhǔn)備好遠(yuǎn)心端血管斷裂口，并再套一個(gè)未收縮的套管材料(直徑5mm，長度4mm)于遠(yuǎn)心端血管外；③分別用鑷子夾持被形狀記憶套管支撐好的兩個(gè)斷裂口并對齊，用Histoacry?組織膠水均勻涂抹并粘合；④將遠(yuǎn)端未收縮的套管移動(dòng)至吻合口，用少量溫生理鹽水(50℃)加溫，形狀記憶套管回縮至原來直徑形狀，覆蓋于斷裂吻合口位置。模擬圖和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)圖分別見圖2和圖3。(4)對照組行傳統(tǒng)縫線吻合：以8-0無損傷線行8～12 針的間斷吻合。記錄手術(shù)中其每個(gè)吻合口的吻合時(shí)間及吻合口通暢情況。

圖2 利用可吸收形狀記憶套管行血管端端吻合的模擬示意圖

圖3 利用可吸收形狀記憶套管行大鼠腹主動(dòng)脈端端吻合的手術(shù)過程

2.組織學(xué)檢測:(1)HE染色:收集術(shù)后1周、6周的吻合血管，用4%多聚甲醛固定組織樣本，石蠟包埋，縱向剖開血管腔做7μm厚的切片，經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下觀察吻合口管腔直徑、異物反應(yīng)、內(nèi)皮增生程度及周圍的炎性細(xì)胞并記錄每高倍視野下炎性細(xì)胞數(shù)量。(2)CD68染色：收集術(shù)后6周實(shí)驗(yàn)組及縫合組血管的吻合口組織，4%多聚甲醛固定后，做7μm厚的縱向血管切片，按照CD68抗體免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察CD68陽性細(xì)胞并記錄每高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)量。

3.影像學(xué)檢測：(1)血管造影(CTA)：術(shù)后6周，經(jīng)大鼠頸靜脈插管注入造影劑，行大鼠腹主動(dòng)脈的CTA檢測，評估實(shí)驗(yàn)組及對照組血管通暢性。(2)血管彩超檢測：在術(shù)后6周利用多普勒超聲經(jīng)大鼠腹部測量血管吻合口周圍官腔直徑及血流量。(3)掃描電鏡(SEM):取術(shù)后6個(gè)月吻合血管，縱向剖開官腔，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，利用掃描電鏡觀察血管內(nèi)皮愈合情況。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.血管吻合模型建立及吻合時(shí)間、通暢率:利用可吸收形狀記憶套管成功實(shí)現(xiàn)了血管斷端的吻合，實(shí)驗(yàn)組30只大鼠吻合血管所需平均時(shí)間為13min，而傳統(tǒng)縫合法所需平均時(shí)間為55min(圖4)，且實(shí)驗(yàn)組和縫合組的即時(shí)通暢率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)，表明這種新型吻合方法是一種可靠且省時(shí)的吻合方法。

2.吻合口HE染色:通過觀察術(shù)后6周及6月吻合口周圍的組織可以看出，縫合組與實(shí)驗(yàn)組比較(圖6)，吻合口周圍有大量炎性細(xì)胞增生，且縫合組有較多的巨噬細(xì)胞存在。通過術(shù)后1周、6周、6個(gè)月縫線吻合法與新型無縫線吻合法吻合口周圍每高倍視野的炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖7)，術(shù)后6周及6個(gè)月時(shí)無縫線組吻合口周圍的炎性細(xì)胞數(shù)明顯少于縫線組。

圖4 新型無縫線吻合法與傳統(tǒng)縫線吻合法行血管端端吻合術(shù)時(shí)吻合時(shí)間的比較

圖5 新型無縫線吻合法與傳統(tǒng)縫線吻合法行血管端端吻合術(shù)后血管即時(shí)通暢率的比較

圖6 吻合口組織HE染色(×50)

圖7 術(shù)后1周、6周、6個(gè)月縫線吻合法與新型無縫線吻合法吻合口周圍每高倍視野的炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)

3.吻合口周圍免疫組化檢測：通過對術(shù)后6周縫線吻合組(圖8B)與無縫線組(圖8A)吻合口組織免疫組化染色，表明縫線組比無縫線組引起了更多CD68+細(xì)胞的表達(dá)(P<0.05)。通過在高倍視野下的細(xì)胞計(jì)數(shù)，縫合組每高倍視野下CD68+細(xì)胞數(shù)為78±10個(gè)，而實(shí)驗(yàn)組僅為30±4個(gè)(圖8)。

圖8 術(shù)后6周吻合口組織免疫組化染色

4.CTA：術(shù)后6周縫線吻合組(圖9B)與無縫線組(圖9A)的CTA，表明縫線組與無縫線組都能成功實(shí)現(xiàn)斷端血管的通暢(P>0.05)。術(shù)后6周的CTA可以看出，實(shí)驗(yàn)組及縫合組吻合口遠(yuǎn)端均有造影劑通過，表明兩種方法都能成功實(shí)現(xiàn)斷端血管的通暢，但是縫合組中可以看到吻合口周圍有明顯的狹窄，而實(shí)驗(yàn)組并沒觀察到明顯的狹窄存在，表明新縫合法能夠在一定程度上降低血管遠(yuǎn)期狹窄的可能性。

圖9 術(shù)后6周的CTA

5.血管彩色多普勒：術(shù)后6周縫線吻合組(B)與無縫線組(A)的多普勒超聲結(jié)果比較，表明無縫線組與縫線組在血管直徑及血流量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖10)。術(shù)后6周的血管彩色多普勒檢測結(jié)果可以看出實(shí)驗(yàn)組與縫合組的血管直徑及血流量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖10 術(shù)后6周多普勒超聲結(jié)果

6.吻合口愈合情況：術(shù)后1年縫線吻合組與無縫線組的掃描電鏡結(jié)果比較，無縫線組比縫線組引起了較少的內(nèi)皮損傷(圖11)。可以看出兩種方法均恢復(fù)了血管內(nèi)皮的連續(xù)性，完成了斷端血管的愈合，但實(shí)驗(yàn)組中吻合口較平整光滑且未形成明顯的縮窄環(huán)。

討 論

目前應(yīng)用的各種血管吻合方法基本分為兩類，針線縫合法和無縫線吻合法。中小血管的針線縫合法常需要在顯微鏡下操作，對術(shù)者的操作技能要求極高。即使有熟練的操作技術(shù)，仍有不可避免的缺陷：縫合過程中常需夾閉兩斷端，這將使遠(yuǎn)端斷肢處于暫時(shí)缺血狀態(tài)，縫合時(shí)間過長將加重受損肢體的進(jìn)一步缺血性損傷；吻合口張力通常較大，縫線過緊將導(dǎo)致血管壁縫線拖拉損傷，而且縫線過松則漏血，血管吻合口的狹窄和血管痙攣是血管遠(yuǎn)期和近期通暢率不佳的主要原因，對血管壁的全層針刺損傷及作為異物存留的縫線常導(dǎo)致吻合口周圍炎性細(xì)胞增生及異物肉芽腫形成，這將引起吻合口的狹窄，導(dǎo)致斷端血管的遠(yuǎn)期通暢率不理想。在過去40 多年中，直徑>6mm的大血管的縫線吻合操作比較成熟，術(shù)后 5 年通暢率超過95%，而直徑≤6mm的中小血管吻合術(shù)多在5 年內(nèi)發(fā)生吻合口狹窄[6]。吻合口狹窄的主要原因是血管壁對其損傷的反應(yīng)性重構(gòu)及內(nèi)膜增生[7]。為防止血管吻合后再狹窄，應(yīng)該避免或減輕各種原因所致的血管壁損傷，術(shù)中提倡“無接觸技術(shù)”(no touch technique)，最大限度地減少手及器械與血管壁的接觸。但血管顯露、血管橫斷以及傳統(tǒng)血管吻合等對血管壁的縫針穿刺和縫線拖拉是不可避免的，所以從血管吻合的方式上尋找突破口是重要研究方向。因此研究者試圖尋求更理想的無線血管吻合方法，這些吻合方法可總括為：套入吻合法、熱凝吻合法、黏合吻合法及機(jī)械吻合法[8～11]。

血管機(jī)械吻合法是目前國內(nèi)外研究最多的無線吻合方法，由于其避免了吻合口處內(nèi)膜的損傷，因此可最大程度地避免吻合口的狹窄。按吻合原理，現(xiàn)代機(jī)械性血管吻合方法分為5大類型：① 磁管法；②訂書針法；③ 套管法；④吻合夾法；⑤針環(huán)法等[12～16]。①、②因缺點(diǎn)較多已基本棄用；③套管法的其原理是一側(cè)血管穿過套管，邊緣外翻180o包住套管，插入另一側(cè)血管腔內(nèi)，并環(huán)形結(jié)扎固定而完成吻合。采用鉆有數(shù)個(gè)小孔的套管，血管行套管吻合后，用小針穿過血管壁插入小孔中，以防止血管滑動(dòng)，即內(nèi)鎖套管法。盡管1984年Daniel等[17,18]創(chuàng)用套管耦合器將此法進(jìn)行了改進(jìn)，但有幾個(gè)缺陷是無法克服的：靠套入后的結(jié)扎生物力學(xué)不安全，稍微有張力吻合口有滑開的可能，如果用內(nèi)鎖套管法又損傷了血管內(nèi)膜。外翻180°增加了操作難度，對僵硬的血管更是如此。需耗費(fèi)一段血管；④吻合夾法：血管吻合夾吻合法(VCS)是由Kirsch等[19]于1992年首先創(chuàng)用的，其吻合原理為，先以外翻鉗將兩斷端血管壁外翻對齊，吻合夾由“C”形變?yōu)榻啤癘”形夾合血管壁。盡管近幾年國內(nèi)外有研究對此進(jìn)行了基礎(chǔ)研究和臨床嘗試，但這種方法操作并不簡便，因?yàn)閱尉蛿喽搜鼙谕夥瓕R這一操作沒有器械輔助非常不方便，而輔助器械的結(jié)構(gòu)又很復(fù)雜，不易加工制作；另外一個(gè)顯而易見的缺點(diǎn)就是血管吻合夾夾合程度很難確定，夾合輕，吻合口有脫開的危險(xiǎn)，夾合重，管腔狹窄。因此限制了臨床使用；⑤針環(huán)法：研究較深入，發(fā)展較快，應(yīng)用亦較多。其主要裝置是兩個(gè)各帶有均勻相間6根小針及6個(gè)小孔的聚四氟乙烯小環(huán)，吻合時(shí)分別將兩血管斷端穿過兩個(gè)小環(huán)并外翻90°固定于6根小針上，兩環(huán)針孔相嵌對而完成吻合。1962年，Nakayama等[20]將針環(huán)材料改為金屬，特制2把持環(huán)鉗用來夾持針環(huán)，簡化了對合過程，并將嵌合后的小針壓彎，使兩針環(huán)牢固。此器械吻合簡單迅速，通暢率高，可由單人操作。但是，堅(jiān)硬的聚乙烯環(huán)永久地留在吻合口，限制血管收縮、擴(kuò)張等調(diào)節(jié)功能和血管的生長，不能用于未成年患者[21]。殘留的不銹鋼針可引起異物反應(yīng)，在血管外膜形成肉芽腫。

本研究中無縫線吻合用到的可吸收記憶套管材料主要成分為為聚己內(nèi)酯，為美國FDA批準(zhǔn)臨床使用材料，添加的輔料偶聯(lián)劑為烴氧基硅烷[5]。多官能團(tuán)單體選自含2～3個(gè)烯鍵的有機(jī)酯，如季戊四醇三烯酸酯等；填料選自含有活性鈣離子的化合物，如磷酸氫鈣等，均為生物相容性良好，且可吸收的材料。研究證實(shí)其具有良好的生物相容性，對細(xì)胞增殖無不利作用，在體內(nèi)也沒有引起炎性反應(yīng)、過敏及其他不良反應(yīng)[22]。利用可吸收形狀記憶套管作為斷端橋接載體，由于該材料在術(shù)后3個(gè)月左右才可完全生物降解，術(shù)中及術(shù)后一段時(shí)間可對血管吻合口起臨時(shí)性支撐作用。利用套管的支撐作用，術(shù)中可使兩斷裂口緊密對合，有利于組織膠水涂抹均勻，從而使吻合口粘合牢固。斷裂口粘合完畢后，在斷裂口外部再套一形狀記憶套管可對吻合口起臨時(shí)性保護(hù)作用。該無縫線吻合法操作流程較針線縫合簡單，在實(shí)驗(yàn)中完成血管吻合的平均時(shí)間為13min，這將大大降低組織的缺血性損傷時(shí)間, 操作過程中完全沒有對血管壁的穿刺性損傷，能避免血管壁對損傷的反應(yīng)性重構(gòu)及內(nèi)膜增生(vascular intimal hyperplasia, VIH)，不會(huì)引起血管吻合口炎性細(xì)胞大量增生，也不會(huì)有縫線所引起的異物肉芽腫，從而能有效的防止血管吻合口的狹窄，也不存在血管吻合后的血管痙攣引起的組織缺血，因而能提高血管近期及遠(yuǎn)期通暢率，提高血管吻合術(shù)成功率。

筆者利用可吸收形狀記憶套管建立了一種新的無縫線微小血管吻合方法。該吻合方法與傳統(tǒng)針線縫合比較具有以下優(yōu)勢：吻合操作簡單，吻合所需時(shí)間少，能明顯減少血管血流阻斷時(shí)間，防止血流阻斷時(shí)間過長而引起相應(yīng)的并發(fā)癥。操作過程中完全沒有對血管壁的穿刺性損傷，吻合口術(shù)后炎性反應(yīng)較輕，血管吻合口內(nèi)皮無異物肉芽腫組織，能減少血管吻合口狹窄的發(fā)生率，保證血管的通暢率。由于操作簡單易掌握，將極大地促進(jìn)血管吻合手術(shù)的普及，為更多的患者解除痛苦，因此該吻合系統(tǒng)具有極強(qiáng)的臨床可行性和深遠(yuǎn)的社會(huì)效益。