CCND1基因多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系

高琳琳 宋 光

胃癌是最常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的第二大致死因素[1]。據(jù)全國(guó)腫瘤登記中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年中國(guó)癌癥新增429.16萬(wàn)例，死亡281.42萬(wàn)例，其中胃癌67.91萬(wàn)例，在各類癌癥中占比15.82%；因胃癌死亡49.8萬(wàn)例，在各類癌癥中占比17.69%，居發(fā)生率和病死率的第2位[2]。胃癌是一種多種病因的復(fù)雜疾病，其病因包括幽門螺桿菌感染、遺傳因素和某些環(huán)境飲食因素，比如食用含有致癌硝酸鹽的腌制食品、生活方式、煙草、乙醇等。在影響胃癌發(fā)病的多種因素中，遺傳易感性仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。遺傳易感性的不同主要來(lái)自于基因的多態(tài)性，其中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是最常見(jiàn)的變異。SNP是決定人類疾病易感性的核心信息，它能夠更加真實(shí)地體現(xiàn)不同人群個(gè)體之間的遺傳差異，因此被認(rèn)為是新一代的遺傳標(biāo)記。

腫瘤被認(rèn)為是一種細(xì)胞周期性疾病，現(xiàn)已經(jīng)證明細(xì)胞周期調(diào)控似乎在幾種類型癌癥的細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，它可以影響線粒體代謝、通過(guò)DNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色體不穩(wěn)定性的誘導(dǎo)等[3]。CyclinD家族(細(xì)胞周期蛋白)是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)器，其中最重要的是細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1，CCND1)。CCND1貫穿了整個(gè)細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)了細(xì)胞周期不同階段的進(jìn)展，在細(xì)胞周期中起到特定作用。它通過(guò)與周期素依賴性蛋白激酶4或6(CDK4或CDK6)結(jié)合形成復(fù)合體，并作為其調(diào)節(jié)亞基起作用，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，其活性是從G1向S期轉(zhuǎn)變所必需的[4]。編碼CCND1的基因,即CCND1基因,被稱為原癌基因，它作為有絲分裂的信號(hào)傳感器，通常在腫瘤細(xì)胞中的數(shù)量上發(fā)生改變，其基因擴(kuò)增和蛋白質(zhì)過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞周期縮短，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自主無(wú)限性增殖[5～7]。

CCND1基因存在多態(tài)性位點(diǎn)，即具有單核苷酸多態(tài)性，其中研究最多的是在核苷酸870(242位密碼子)處的G/A多態(tài)性。許多研究表明，CCND1基因多態(tài)性與多種腫瘤有相關(guān)性，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌等，但研究結(jié)果不盡相同，且與胃癌關(guān)系的研究較少[8，9]。因此，本研究采用病例對(duì)照研究，選取CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129多態(tài)性位點(diǎn)，探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為將來(lái)胃癌的早期診斷、篩查及治療提供線索。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：收集2016年10月～2017年10月期間在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院就診的胃癌患者292例(病例組)，所有患者均經(jīng)臨床和病理證實(shí)確診為胃癌，均未進(jìn)行過(guò)放療和化療，且為原發(fā)性胃癌，排除繼發(fā)性或復(fù)發(fā)性腫瘤及其他惡性腫瘤。選取同期哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者298例為對(duì)照組，既往均無(wú)腫瘤遺傳病史，對(duì)照組與病例組患者的性別、年齡情況相匹配，兩組人群無(wú)血緣關(guān)系。

2.方法：(1)血液基因組DNA提取:抽取研究對(duì)象外周靜脈血2ml，采用天根生物技術(shù)有限公司提供的血液基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，將提取的DNA于-20℃冰箱保存。(2)PCR擴(kuò)增目的基因片段:根據(jù)CCND1基因組序列設(shè)計(jì)CCND1基因 rs9344、rs7177、rs1944129位點(diǎn)PCR引物。rs9344引物序列：上游引物:5′-GAACCTGAGGAGCCCCAACAAC-3′，下游引物:5′-GGCACTAGGTGTCTCCCCCTGT-3′。rs7177引物序列：上游引物：5′-AGGTGGACCTGGCTTGCACAC-3′，下游引物：5′-AAAACAACCAACAACAAGGAGAATGAA-3′。rs1944129引物序列：上游引物：5′-CCCCATTGGCTCATGCTAATTC-3′，下游引物：5′-GATTTATGGGGCCCGGAGCTAT-3′。PCR反應(yīng)體系(20μl)包含1×HotStarTaq buffer, 3.0mmol/L Mg2+, 0.3mmol/L dNTP, 1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 樣本DNA和1μl多重PCR引物。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min后，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次，最后72℃10min，4℃保溫。進(jìn)行多重PCR產(chǎn)物純化，用連接酶連接擴(kuò)增產(chǎn)物。(3)DNA測(cè)序:取0.5μl 稀釋后的連接產(chǎn)物，采用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

結(jié) 果

1.兩組一般資料比較：292例胃癌患者中，其中男性207例，女性85例；298例對(duì)照組人群中，其中男性203例，女性95例。病例組患者的平均年齡為56.93±10.19歲，對(duì)照組人群平均年齡為55.75±11.14歲。胃癌患者和對(duì)照組年齡和性別的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組人群具有可比性，詳見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)：經(jīng)過(guò)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，兩組患者基因型的觀察值和期望值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位點(diǎn)基因型頻率符合遺傳平衡定律，所選樣本具有代表性,詳見(jiàn)表2。

表2 CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

3.CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系：病例組和對(duì)照組CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位點(diǎn)的基因型頻率，詳見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組比較，CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位點(diǎn)基因型分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系[n(%)]

討 論

胃癌是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)的危害全球人類健康的惡性腫瘤之一，當(dāng)今社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療水平逐步發(fā)展以及人類食物多樣性大大增加，然而胃癌在全世界范圍內(nèi)發(fā)生率和病死率始終居高不下。胃癌的初期癥狀不甚明顯，初期診斷率較低，多半患者自覺(jué)較重癥狀來(lái)醫(yī)院就醫(yī)時(shí)已經(jīng)到了中期或晚期。胃癌的治療手段包括手術(shù)治療、化療和放療，雖然這些治療措施顯著提高了患者的生存率，但是預(yù)后仍較差，總體5年生存率僅為30%[10]。因此尋找到特異性生物標(biāo)志物，可以幫助胃癌的早期診斷、篩查及藥物靶向治療等。目前有大量的研究證明遺傳基因的多態(tài)性在胃癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中關(guān)聯(lián)密切，其中SNP是能夠作為新一代遺傳學(xué)標(biāo)記的突變形式。

CCND1 基因位于1lql3 染色體，包括5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)約15kb，編碼細(xì)胞周期蛋白D1[11]。細(xì)胞周期蛋白D1是充當(dāng)真核細(xì)胞周期的關(guān)鍵控制元件的蛋白質(zhì)，它們的蛋白質(zhì)水平在整個(gè)細(xì)胞周期中顯著且周期性地改變。每個(gè)細(xì)胞周期蛋白表現(xiàn)出特征性表達(dá)和降解模式，這有助于有絲分裂事件的時(shí)間協(xié)調(diào)。細(xì)胞周期蛋白D1與CDK4或6結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，其主要作用是能夠磷酸化并滅活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb蛋白)，因?yàn)镽b蛋白通過(guò)其抑制E2F轉(zhuǎn)錄活性的能力來(lái)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[5]。在G1期，細(xì)胞需要做出決定是否進(jìn)入另一個(gè)分裂，或者退出細(xì)胞周期進(jìn)入靜止期(G0)響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)，細(xì)胞周期蛋白D1作為有絲分裂信號(hào)傳感器，表現(xiàn)為對(duì)許多促有絲分裂信號(hào)的延遲早期反應(yīng)，迫使細(xì)胞從G0期進(jìn)入增殖周期。除了CDK依賴的功能之外，現(xiàn)在積累的大量證據(jù)表明，細(xì)胞周期蛋白D1也可以作為類固醇激素受體如雌激素受體的轉(zhuǎn)錄輔因子，除了腫瘤的形成，細(xì)胞周期蛋白D1還可以通過(guò)惡性細(xì)胞與宿主環(huán)境之間的相互作用在侵襲性和轉(zhuǎn)移表型中起關(guān)鍵作用[11]。此外，細(xì)胞周期蛋白D1通常在血管生成和線粒體功能中起調(diào)節(jié)作用，這表明，細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)可能有助于腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能。

細(xì)胞周期蛋白D1在幾種人類腫瘤中過(guò)度表達(dá)，其作用機(jī)制包括染色體易位、基因擴(kuò)增和蛋白質(zhì)水解的破壞等[11]?，F(xiàn)在已經(jīng)在公共SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP)中鑒定并分類了超過(guò)250個(gè)跨越CCND1的SNP，其中CCND1G870A(rs9344)多態(tài)性位點(diǎn)在腫瘤中研究最多[12]。CCND1 870G/A(rs9344)SNP分為GG型、GA型和AA型，可以調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)mRNA的剪接頻率，其產(chǎn)生2個(gè)轉(zhuǎn)錄物，A等位基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物b，G等位基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物a，轉(zhuǎn)錄物編碼具有功能性細(xì)胞周期蛋白盒的蛋白質(zhì)(氨基酸55～161)。然而，轉(zhuǎn)錄物b缺少負(fù)責(zé)CCND1降解的PEST序列，這可能使轉(zhuǎn)錄物b編碼的蛋白質(zhì)比轉(zhuǎn)錄物a有更長(zhǎng)的半衰期，因此具有CCND1 870A變體的個(gè)體更有可能繞過(guò)G1～S細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，從而導(dǎo)致癌癥細(xì)胞異常增殖[13]。然而，也有研究表明G等位基因也可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物b，A等位基因也可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物a，這說(shuō)明A等位基因可能不是轉(zhuǎn)錄物b生產(chǎn)的普遍需要。

Kuo等[14]通過(guò)對(duì)358例胃癌患者與358例健康者的研究中發(fā)現(xiàn)，CCND1rs9344位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，攜帶AG和GG基因型的受試者與CCND1rs9344上攜帶AA基因型的受試者相比具有較低的胃癌風(fēng)險(xiǎn)，因此CCND1 rs9344的AG和GG基因型可能是胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)測(cè)的保護(hù)性標(biāo)志物。Kuo等[16]還調(diào)查了CCND1G870A基因型與個(gè)人吸煙狀況對(duì)胃癌風(fēng)險(xiǎn)的相互作用，發(fā)現(xiàn)兩者之間有協(xié)同作用，并可能增加臺(tái)灣地區(qū)民眾胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。Tahara等[15]研究表明CCND1 G870A基因多態(tài)性與胃癌CpG島啟動(dòng)子甲基化高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，這是第一份顯示CCND1多態(tài)性與胃癌高甲基化狀態(tài)之間潛在關(guān)聯(lián)的報(bào)告。一項(xiàng)Meta分析評(píng)估了CCND1rs9344多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)亞洲人群中CCND1rs9344多態(tài)性與胃癌發(fā)生之間無(wú)相關(guān)性，但可能增加高加索人的胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[16]。這表明基因多態(tài)性可能存在地域差異，可能與人群種族及生活方式的不同有關(guān)。

關(guān)于CCND1 rs7177位點(diǎn)多態(tài)性，有研究表明，它與腎癌、頭頸部腫瘤等發(fā)病有關(guān)[3，17]。Petkevicius等[18]探究了歐洲人CCND1 rs7177 SNP與胃癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)兩者之間的相關(guān)性，這與本研究結(jié)果是一致的。對(duì)于CCND1 rs1944129位點(diǎn)，Xue等[3]證實(shí)了其多態(tài)性與腎癌相關(guān)，但其與胃癌易感性之間的關(guān)系未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。本研究探討了CCND1 rs1944129位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌的關(guān)系，結(jié)果顯示：病例組中rs1944129位點(diǎn)基因CC型、CT型、TT型出現(xiàn)的頻率分別為3.36%、35.57%、61.07%，對(duì)照組中基因型分別為5.14%、29.79%、65.07%，兩組基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究結(jié)果表明rs1944129位點(diǎn)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能無(wú)相關(guān)性。

本研究采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究，分析了CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果顯示，CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。其原因可能是本研究樣本量較小，在選擇研究對(duì)象時(shí)有許多限制，這可能使相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)效力存在一定的局限性，而且不能完全排除可能與特定基因型相關(guān)的受試者選擇偏倚的可能性。另外，基因與環(huán)境等多種因素的相互作用、種族地域差異、個(gè)體的遺傳異質(zhì)性等也可能是其影響因素。CCND1基因多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，需要更大樣本、大規(guī)模和精心設(shè)計(jì)的研究。