妊高癥患者胎盤(pán)MiR-26b和Nkx2-5的表達(dá)水平及臨床意義

魏 娜 李江麗 宋亞南

妊娠高血壓疾病(pregnancy-induced hypertension，PIH)簡(jiǎn)稱(chēng)妊高癥，為女性妊娠期特有的疾病，病因尚不明確，為全球性產(chǎn)科難題。中國(guó)妊高癥的發(fā)生率為9.4%，為導(dǎo)致孕產(chǎn)婦、圍生兒發(fā)病甚至死亡的主要原因之一[1，2]。目前尚缺乏特異、敏感的生物標(biāo)志物對(duì)妊高癥進(jìn)行盡快診斷。microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，通過(guò)調(diào)控靶mRNA降解與翻譯抑制從而使靶基因表達(dá)下調(diào)，且miRNAs表達(dá)具有組織、器官特異性[3]。雖然妊高癥的發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，但研究者認(rèn)識(shí)到胎盤(pán)可能是引發(fā)妊高癥的主要誘因，因?yàn)殡S著胎盤(pán)排出體外，妊高癥癥狀逐漸消失。近年來(lái)研究表明，在妊高癥孕婦的胎盤(pán)中大量miRNAs表達(dá)異常[4，5]。Nkx2-5是最早發(fā)現(xiàn)的與先天性心臟病相關(guān)的基因，但其在妊高癥中的作用還未被研究[6]。故本研究通過(guò)探究MiR-26b、Nkx2-5在妊高癥患者胎盤(pán)中的表達(dá)水平及臨床意義，以期為妊高癥的臨床診斷提供一定的參考價(jià)值。

資料與方法

1.臨床資料：選擇2016年3月～2017年10月于筆者醫(yī)院婦產(chǎn)科接受治療的60例妊高癥患者為實(shí)驗(yàn)組，其中包括20例妊娠期高血壓患者、20例輕度子癇前期患者和20例重度子癇前期患者，患者年齡21～34歲，平均年齡28.08±4.52歲，平均孕周37.84±3.48周，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸主編的《婦產(chǎn)科學(xué)(第8版)》[7]。另選擇同期住院的20例健康孕婦作為對(duì)照組，年齡23～32歲，平均年齡27.96±2.74歲，平均孕周38.78±3.66周。所選病例均為單胎初產(chǎn)婦，無(wú)原發(fā)性心臟、肝臟、腎臟疾病史，無(wú)其他妊娠并發(fā)癥及合并癥。各組產(chǎn)婦間年齡、孕周等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.主要試劑：MirVanaTMmiRNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；Taqman microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqman Universal PCR Master Mix及MiR-26b、U6引物購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；組織蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；小鼠抗人Nkx2-5單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.標(biāo)本收集：所有孕婦在胎盤(pán)娩出后，留取胎盤(pán)中部的新鮮組織，注意避開(kāi)鈣化、壞死區(qū)，分成2份，于液氮中凍存待用。

4.qRT-PCR檢測(cè)胎盤(pán)組織MiR-26b水平：取出液氮凍存的胎盤(pán)組織，采用MirVanaTMmiRNA提取試劑盒提取miRNA，操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度后，取2μg RNA，采用Taqman microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用Taqman Universal PCR Master Mix檢測(cè)MiR-26b表達(dá)，20μl體系配制如下：Taqman Master Mix 10μl、Taqman miRNA assay Mix 1μl、cDNA 1.5μl、ddH2O 7.5μl?；靹蚝笾糜趯?shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Beckman Couhe公司)上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。選取U6為內(nèi)參，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR結(jié)果，ΔCT=(CTMiR-26b- CTU6)±SD；ΔΔCT=(ΔCTMiR-26b-ΔCTU6)±SD。MiR-26b與U6引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 MiR-26b與U6引物序列

5.Western blot法檢測(cè)胎盤(pán)組織Nkx2-5 水平：取出液氮凍存的胎盤(pán)組織，充分研磨，用組織蛋白提取試劑常規(guī)提取蛋白。取適量蛋白樣品，BCA法定量后調(diào)節(jié)濃度；將蛋白樣品與2×SDS緩沖液等體積混合，加熱變性；SDS-PAGE電泳分離蛋白；將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜；將膜清洗后浸沒(méi)于5%牛血清蛋白溶液中，室溫封閉1h；將膜清洗后浸沒(méi)于一抗稀釋液(小鼠抗人Nkx2-5一抗溶液按1∶100比例稀釋)中，4℃孵育過(guò)夜；次晨將膜清洗后浸沒(méi)于二抗稀釋液(FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG按1∶1000比例稀釋)中，室溫孵育2 h；將膜清洗后浸沒(méi)于新配制的顯色液中顯色，待出現(xiàn)清晰的條帶時(shí)停止。選取β-actin為內(nèi)參蛋白。采用GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。

結(jié) 果

1.各組病例間的一般臨床資料比較：輕度子癇前期組和重度子癇前期組的新生兒體重及胎盤(pán)重量較健康對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)，妊娠期高血壓組的新生兒體重及胎盤(pán)重量與健康對(duì)照組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組病例間的一般臨床資料比較

與健康對(duì)照組比較，*P<0.05

2.各組胎盤(pán)組織中MiR-26b表達(dá)水平：qRT-PCR結(jié)果顯示，妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組和重度子癇前期組胎盤(pán)組織中MiR-26b的表達(dá)水平較健康對(duì)照組均顯著升高(P<0.05)，且隨著病情的加重，MiR-26b的表達(dá)水平逐漸上升(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組胎盤(pán)組織中MiR-26b表達(dá)水平比較

與健康對(duì)照組比較，*P<0.05

3.各組胎盤(pán)組織中Nkx2-5表達(dá)水平：Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組和重度子癇前期組胎盤(pán)組織中Nkx2-5的蛋白表達(dá)水平較健康對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)，且隨著病情的加重，MiR-26b的蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖1、表4。

圖1 各組胎盤(pán)組織中Nkx2-5的Western blot檢測(cè)結(jié)果

表4 各組胎盤(pán)組織中Nkx2-5蛋白相對(duì)表達(dá)灰度值

與健康對(duì)照組比較，*P<0.05

4.妊高癥患者胎盤(pán)組織MiR-26b、Nkx2-5表達(dá)水平的相關(guān)性：胎盤(pán)組織中MiR-26b表達(dá)水平與Nkx2-5蛋白表達(dá)水平顯著呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 妊高癥患者胎盤(pán)組織中MiR-26b、Nkx2-5表達(dá)水平的相關(guān)性

5.妊高癥患者胎盤(pán)組織MiR-26b、Nkx2-5水平與新生兒體重、胎盤(pán)重量的相關(guān)性：妊高癥患者胎盤(pán)組織MiR-26b水平與新生兒體重、胎盤(pán)重量顯著呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Nkx2-5水平與新生兒體重、胎盤(pán)重量顯著呈正相關(guān)(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 妊高癥患者胎盤(pán)組織MiR-26b、Nkx2-5水平與新生兒體重、胎盤(pán)重量的相關(guān)系數(shù)

*P<0.05

討 論

妊高癥是妊娠時(shí)出現(xiàn)的常見(jiàn)疾病，以大量血管收縮、子宮胎盤(pán)灌注不足為主要特征[8]。WHO數(shù)據(jù)顯示，妊高癥的發(fā)生率為6%～10%[9]。妊娠高血壓疾病的臨床特征很多，包括蛋白尿性高血壓(子癇前期)、非蛋白尿性高血壓、疊加子癇前期的慢性高血壓和不疊加子癇前期的慢性高血壓。蛋白尿性高血壓若治療不及時(shí)，將會(huì)發(fā)展成極為嚴(yán)重的子癇，最后可造成患者流產(chǎn)，甚至導(dǎo)致產(chǎn)婦、圍生兒死亡，或者遺傳給胎兒，導(dǎo)致胎兒患有先天性高血壓[10～12]。目前妊高癥尚未有特異、高效的治療方法，若能對(duì)妊高癥的跡象及早檢出，可避免絕大部分母體、胎兒并發(fā)癥的發(fā)生。

miRNAs是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)度為21～23nt的小RNA，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、應(yīng)激等各種生命活動(dòng)，顯示miRNAs可能具有多樣化的生理功能。在不一樣的組織、器官及發(fā)育階段，miRNAs表達(dá)存在大量差異，而且體內(nèi)存在特定的小分子顆粒能保護(hù)miRNAs避免與RNA酶接觸而被分解掉，故而在血漿和組織中的miRNAs可很穩(wěn)定地存在[13～15]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，miRNAs表達(dá)異?？稍斐善浒谢虮磉_(dá)也異常，從而對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重大影響[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，胎盤(pán)組織中有一些miRNAs大量表達(dá)，而在孕婦體內(nèi)胎盤(pán)組織以“偽腫瘤”的狀態(tài)存在，暗示胎盤(pán)miRNAs很有可能參與調(diào)控胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，如缺氧時(shí)胎盤(pán)中MiR-210含量急劇上升，結(jié)果造成胎盤(pán)線(xiàn)粒體功能異常[17，18]。胎盤(pán)中MiR-20a高表達(dá)可對(duì)FOXA1表達(dá)產(chǎn)生抑制，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的增殖、侵襲能力造成影響。近期有研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期胎盤(pán)中MiR-26a顯著升高，其可能通過(guò)靶向Smad1調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞系的增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，妊高癥患者胎盤(pán)組織中MiR-26b的表達(dá)水平較健康對(duì)照組均顯著升高，且隨著病情的加重，MiR-26b的表達(dá)水平逐漸上升，且與新生兒體重、胎盤(pán)重量呈負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果表明妊高癥患者胎盤(pán)組織MiR-26b表達(dá)顯著上調(diào)，且與病情有關(guān)，MiR-26b有望成為妊高癥的臨床診斷因子。

妊娠中晚期出現(xiàn)的妊高癥若未得到有效診斷與治療可造成胎兒致死或不良妊娠后果，導(dǎo)致這種結(jié)局的主要原因是胎兒心功能不良[20，21]。Nkx2-5是影響心臟發(fā)育過(guò)程最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，Nkx2-5基因發(fā)生突變，可造成其蛋白產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄活性降低，進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致心臟發(fā)育畸形，結(jié)果造成先天性心臟病的發(fā)生[22]。心臟發(fā)育成熟后，Nkx2-5表達(dá)區(qū)域有限，僅在心臟房室肌細(xì)胞表達(dá)，但對(duì)心臟活動(dòng)的正常進(jìn)行至關(guān)重要；心臟發(fā)育過(guò)程中Nkx2-5表達(dá)異常易引發(fā)先天性心臟病，也可能對(duì)成年后心臟的正常功能造成影響，暗示Nkx2-5在妊高癥患者胎盤(pán)中的表達(dá)也可能出現(xiàn)了異常。本研究發(fā)現(xiàn)，妊高癥患者胎盤(pán)組織中Nkx2-5的蛋白表達(dá)水平較健康對(duì)照組均顯著降低，且隨著病情的加重，MiR-26b水平不斷降低，且胎盤(pán)組織中MiR-26b水平與Nkx2-5水平呈負(fù)相關(guān)，與新生兒體重、胎盤(pán)重量呈正相關(guān)，這些結(jié)果顯示妊高癥患者胎盤(pán)中Nkx2-5表達(dá)顯著下調(diào)，且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，可能對(duì)胎兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育造成了影響，說(shuō)明Nkx2-5可對(duì)妊高癥的臨床診斷提供參考。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)妊高癥患者胎盤(pán)中MiR-26b表達(dá)顯著上調(diào)、Nkx2-5表達(dá)顯著下調(diào)，它們的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，在重度子癇前期中表達(dá)變化最大，說(shuō)明MiR-26b、Nkx2-5參與了妊高癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，這對(duì)妊高癥的臨床診斷提供有價(jià)值的參考。然而，妊高癥發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素很多，相關(guān)機(jī)制復(fù)雜，MiR-26b、Nkx2-5能否作為妊高癥的診斷因子，還需擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)追蹤時(shí)間進(jìn)一步研究。