高瑩瑩 唐秀鳳 李曉曦 陳宇恒 于 萍 劉仁慧
哮喘是以氣道慢性炎癥為特征的呼吸系統(tǒng)的常見疾病之一,目前發(fā)生率和致死率逐年上升,并在全世界范圍內(nèi)都嚴重威脅公眾健康[1]。哮喘治療的首選藥物糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GC)雖有強大的抗炎作用,但長期或大劑量應用卻容易造成嚴重的難以解決的不良反應[2]。GC作為為甾體激素,發(fā)揮抗炎作用的機制是結(jié)合胞質(zhì)內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR),啟動基因轉(zhuǎn)錄進程,合成相應的發(fā)揮抗炎作用的蛋白質(zhì)[3]。胞質(zhì)內(nèi)GR在未被激活時結(jié)合2分子的熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90),使GR維持預備結(jié)合的狀態(tài)[4]。筆者在前期實驗研究中發(fā)現(xiàn),淫羊藿女貞子合用地塞米松對卵蛋白誘導的哮喘大鼠能產(chǎn)生協(xié)同抗炎、下丘腦-垂體-腎上腺軸及提高GR的結(jié)合力,并證實中藥合用布地奈德氣道吸入緩解哮喘的機制與調(diào)整GR/HSP90的比值有關[5~7]。但對淫羊藿女貞子合用全身給藥的GC——地塞米松對GR/HSP90的影響作用尚未明確。
1.實驗動物:雄性 SD 大鼠,SPF 級,體重120±10g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,實驗動物許可證號:SCXK(京)2012-0001。
2.試劑與藥品:卵清白蛋白(美國 Sigma公司,A5253-250G),氫氧化鋁(北京化工廠,批號:20120028),地塞米松磷酸鈉注射液(5毫克/支,國藥集團容生制藥有限公司,批號:H41020036),HSP 90、GRα一抗,均購自英國Abcam公司,GRβ一抗(biorbyt,E10827);小鼠抗β-actin抗體、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG、 DAB顯色液均購自中杉金橋,RIPA裂解液(Solarbio,20150517),Trizol購自美國Invitrogen公司,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP(10mmol/L)、Ex TaqMix,均由寶生物工程(大連)有限公司提供,引物由上海生工有限公司合成。
3.儀器:402A超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設備有限公司),電泳槽(日本TaKaRa公司),7500型PCR儀(美國ABI公司),Chromo4熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司),凝膠成像系統(tǒng)(韓國Korea Biotech公司)。
4.動物分組及藥物制備方法:42只大鼠隨機分為7組,即正常組(N組)、模型組(A組)、地塞米松組(Dex組)、淫羊藿女貞子煎劑組(YN1組)、淫羊藿女貞子煎劑合地塞米松組(YN1&Dex組)、淫羊藿女貞子提取物組(YN2組)和淫羊藿女貞子提取物合地塞米松組(YN2&Dex組),每組均為6只。淫羊藿女貞子煎液和淫羊藿女貞子提取物制備方法見參考文獻[8,9]。
5.造模、給藥及取材:參考文獻[10]方法于實驗第1~35天,除N組外,其他動物進行造模。Dex組、YN1組、YN1&Dex組、YN2組、YN2&Dex組的給藥方法同參考文獻[11]。第36天處死動物,開胸,取左肺組織,部分4%甲醛固定,其余液氮凍存。
6.檢測方法:免疫組化法(immunohistochemistry,IHC)及Western blot(WB)法檢測肺組織GRα、GRβ、HSP90的蛋白表達,RT-PCR法檢測大鼠的肺組織中GRα、GRβ以及HSP90的 mRNA的表達,具體檢測方法同前[4]。詳見表1。
表1 GRα、GRβ以及HSP90引物序列
1. 各組大鼠肺組織中GRα表達的比較:與正常組相比,模型組和地塞米松組的大鼠肺組織中GRα蛋白及mRNA表達量都明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01);地塞米松組與模型組相比 GRα mRNA表達量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用均能明顯上調(diào)GRα 蛋白(WB法檢測)及mRNA表達(P<0.05或P<0.01)。與地塞米松組比較,淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用仍能顯著上調(diào)GRα 蛋白(WB法檢測)及mRNA表達(P<0.05或P<0.01,表2)。
表2 各組大鼠肺組織中GRα表達的比較
與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與A組比較,#P<0.05,##P<0.01;與Dex組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01
2.各組大鼠肺組織中GRβ 表達的比較:與正常組相比,模型組中GRβ 的mRNA表達量明顯上調(diào)(P<0.05),地塞米松組GRβ 蛋白及mRNA量均明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,地塞米松組GRβ 蛋白的IOD值顯著上調(diào)(P<0.05);淫羊藿女貞子提取物組GRβ 蛋白的陽性面積值顯著降低(P<0.05);中藥淫羊藿女貞子單用組以及淫羊藿女貞子與地塞米松合用組GRβ mRNA的表達均明顯降低(P均<0.01)。與地塞米松組比較,淫羊藿女貞子單用組及淫羊藿女貞子與地塞米松合用組的GRβ 蛋白表達的IOD值和 mRNA的表達都明顯降低(P均<0.01),GRβ 蛋白表達的陽性面積值淫羊藿女貞子提取物合地塞米松組差異無統(tǒng)計學意義,而WB法檢測GRβ 蛋白表達是淫羊藿女貞子與合地塞米松的兩個合用組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01,表3)。
表3 各組大鼠肺組織GRβ 表達的比較
與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與A組比較,#P<0.05,##P<0.01;與Dex組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01
3.各組大鼠肺組織中HSP90表達的比較:與正常組比較,模型組表達的HSP90蛋白和mRNA均明顯降低(P<0.01);地塞米松組HSP90蛋白(IOD值及WB法檢測)及mRNA表達也顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,地塞米松組各值差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.01);其余給藥組HSP90蛋白(陽性面積值及WB法檢測值)及mRNA的表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與地塞米松組比較,淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用共4組均能顯著上調(diào)HSP90蛋白(WB法檢測值)及mRNA的表達(P<0.05或P<0.01),淫羊藿女貞子提取物與地塞米松合用組對IHC法檢測的HSP90蛋白含量均明顯上調(diào)(P<0.05,表4)。
表4 各組大鼠肺組織HSP90表達的比較
與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與A組比較,#P<0.05,##P<0.01;與Dex組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01
4.各組大鼠肺組織GRα/GRβ的比較:與正常組比較,模型組及地塞米松組GRα/GRβ 比值在蛋白及mRNA水平均顯著降低(P均<0.01)。分別與模型組和地塞米松組比較,淫羊藿女貞子與地塞米松兩個合用組在蛋白及mRNA水平上均可上調(diào)GRα/GRβ比值(P<0.05或P<0.01,表5)。此外,相關分析結(jié)果顯示, GRα 與GRβ 在蛋白及mRNA水平的相關系數(shù)r值分別為-0.566(P=0.000)和-0.495(P=0.001)。
表5 各組大鼠肺組織GRα/GRβ的比較
與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與A組比較,#P<0.05,##P<0.01;與Dex組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01
5.各組大鼠肺組織GR亞型/HSP90的比較:與正常組比較,模型組GRα/HSP90在mRNA水平及HSP90/GRβ在蛋白水平均明顯降低(P均<0.01);地塞米松組GRα/HSP90 在mRNA水平及GRβ/HSP90在蛋白及mRNA水平均顯著降低(P均<0.01)。分別與模型組及地塞米松組比較,淫羊藿和女貞子的單用、淫羊藿女貞子與地塞米松合用組均能調(diào)整GRα/HSP90、GRβ/HSP90在mRNA水平上的比值(P均<0.01);淫羊藿女貞子與地塞米松合用組能顯著抑制GRβ/HSP90在蛋白水平的比值(P<0.05或P<0.01)。此外,相關分析結(jié)果顯示, HSP90與GRα 在蛋白及mRNA水平的r值分別為0.708(P=0.000)和0.535(P=0.000);HSP90與GRβ 在蛋白及mRNA水平的r值分別為-0.476(P=0.004)和-0.368(P=0.019,表6)。
表6 各組大鼠肺組織HSP90/GR亞型的比較
與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與A組比較,#P<0.05,##P<0.01;與Dex組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01
哮喘的發(fā)病機制與GR損傷有關,包括GR的數(shù)量下降、結(jié)構(gòu)缺陷以及基因表達調(diào)控的改變等[12]。而使用外源性GC,會使GR的缺陷更加嚴重,表現(xiàn)為哮喘患者對激素的反應性下降。GR有兩種主要的亞型,GRα 和GRβ。GRα 可激活經(jīng)典激素效應,而GRβ不直接與GC結(jié)合,而是與GRα 存在拮抗關系起作用[13]。GRβ表達的增加與GC敏感度降低有明確關系[14,15]。GC 抵抗的發(fā)生可能是與GRα 與GRβ 比值失衡有關[16]。筆者研究發(fā)現(xiàn),哮喘模型及地塞米松組GRα 蛋白和mRNA表達均明顯降低,哮喘模型組GRβ mRNA表達顯著上調(diào),地塞米松組GRβ 蛋白及mRNA表達均明顯上調(diào)。哮喘大鼠經(jīng)地塞米松治療后GRβ蛋白表達的上調(diào)提示哮喘大鼠對激素作用的敏感度降低,可能增加了GC抵抗的發(fā)生。而哮喘大鼠被給予地塞米松合用淫羊藿女貞子煎液或提取物治療后,GRα 的表達明顯增加,且GRβ 的表達被抑制,調(diào)整GRα/GRβ 的比值,提示改善GR亞型的表達及GRα/GRβ的失衡狀態(tài),可能是中藥提高哮喘大鼠對激素作用敏感度的部分機制。
熱休克蛋白HSP90是GR的分子伴侶,可以激活GR使其發(fā)揮作用。在正常情況下,HSP90可以改變GR的立體構(gòu)象,使GR形成能與GC結(jié)合的特異性構(gòu)象,從而使GR可與GC結(jié)合。也就是說HSP90與GR的配體的結(jié)合域結(jié)合后,GR才能與GC高效聯(lián)結(jié)發(fā)揮作用。所以HSP90減少,會使GR上與GC結(jié)合的位點的立體結(jié)構(gòu)不能與GC特異性結(jié)合,雖然有證據(jù)表明不與HSP90結(jié)合的GR也可以接受GC刺激,但對于GC的敏感度是降低的[17]。
HSP90不僅是能使GR激活成可結(jié)合狀態(tài)使其順利發(fā)揮作用,即HSP90的存在可增加類固醇激素的敏感度;另一方面在激活GR后,HSP90對GC的作用效果也起到調(diào)節(jié)作用 ,即當HSP90與GR之比適當時,可增加GC的作用效果;而HSP90與GR之比不在正常范圍內(nèi)則可以降低GC的作用效果。本研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,哮喘模型組HSP90的蛋白表達量和其mRNA表的達量均明顯下調(diào),同時GRα與 HSP90 的mRNA量之比明顯降低,而GRβ/HSP90比值顯著升高。淫羊藿女貞子煎劑和水提物與地塞米松合用后,HSP90 表達顯著上調(diào),GRα/HSP90 或GRβ/HSP90均有顯著的改善。提示中藥淫羊藿女貞子調(diào)整哮喘大鼠對GC作用的敏感度與上調(diào)HSP90 表達,調(diào)整GR亞型與HSP90的比值有關。