一個(gè)共同性外斜視家系基因突變研究

李永蓉，王 慧

(安徽省合肥市第二人民醫(yī)院眼科 230011)

斜視是指由于各種原因所致眼外肌作用不平衡，眼位偏斜的一種眼科常見(jiàn)疾病，分為共同性斜視和非共同性斜視。在亞洲人口中，共同性外斜視最常見(jiàn)[1]，影響兒童視力發(fā)育、雙眼融合功能和立體視，目前發(fā)病原因尚未明確。共同性外斜視具有較高的遺傳性，MATSUO等[2]報(bào)道，共同性外斜視遺傳性表現(xiàn)為多種基因遺傳，并有一些敏感的染色體位點(diǎn)。非共同性外斜視中的先天性眼外肌纖維化(CFEOM)是一種特殊的家族性遺傳疾病，為單基因遺傳。有研究發(fā)現(xiàn)共同性外斜視與非共同性外斜視CFEOM有相似的遺傳基因突變可能性，ARIX基因突變與CFEOM2有關(guān)[3]，最新研究發(fā)現(xiàn) TUBB3基因、細(xì)胞形態(tài)TUBB2b基因與CFEOM3有關(guān)[4]，本研究在共同性外斜視家系中同時(shí)檢測(cè)ARIX、TUBB2b、TUBB3基因，探討ARIX、TUBB2b、TUBB3基因在共同性外斜視遺傳中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者1，女，46歲；患者2，男，41歲。兩例患者為同父母姐弟，2014年7月因共同性外斜視來(lái)本院行手術(shù)治療。經(jīng)追查發(fā)現(xiàn)一個(gè)完整共同性外斜視家系，患者母親年輕時(shí)患有外斜視，已手術(shù)矯正。兩例患者各有1名女兒患有共同性外斜視(隱斜)，暫保守觀察。所有患者及家系為健康人，均足月順產(chǎn)，無(wú)低出生體質(zhì)量、無(wú)吸氧史、無(wú)傳染病史，排除家系其他疾病及遺傳性疾病史。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)取材 本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)評(píng)估(批準(zhǔn)號(hào)：201439)，遵循赫爾辛基宣言，征求患者及家屬同意并簽署知情同意書(shū)后，抽取1名正常親屬外周靜脈血，標(biāo)記為1號(hào)，抽取4例患者外周靜脈血，分別標(biāo)記為2、3、4、5號(hào)。1、2、4號(hào)為親姐弟3人，其中2、4號(hào)為共同性外斜視患者并行斜視矯正手術(shù)；3、5號(hào)分別為4、2號(hào)女兒，患有共同性外隱斜，暫不需治療。5人間有血緣關(guān)系，采取標(biāo)本送ARIX基因突變檢查，并繪制家系圖譜(圖1)。另抽取其他3名無(wú)血緣關(guān)系健康人外周靜脈血作為陰性對(duì)照，分別標(biāo)記為6、7、8號(hào)，和上述5個(gè)標(biāo)本一起送TUBB2b基因、TUBB3基因突變檢查。所有標(biāo)本采取后存放于-80 ℃的冰箱中保存，OMEGA試劑盒，PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2試驗(yàn)方法 通過(guò)對(duì)家系患者外周血基因組DNA提取、引物合成及PCR擴(kuò)增、純化產(chǎn)物測(cè)序，進(jìn)行該家系患者ARIX基因、TUBB2b基因及TUBB3基因與Genbank公布的基因正常序列比對(duì)。試驗(yàn)方法分為基因組DNA提取，引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增，測(cè)序3步進(jìn)行。

1.2.2.1基因組DNA提取 外周血液DNA的提?。翰捎肊.Z.N.A.?血液DNA微量提取試劑盒(Omega公司，美國(guó))，按照說(shuō)明書(shū)提取DNA后測(cè)量基因組DNA的濃度和光密度(OD)值(Nanodrop 2000,Thermofish公司，美國(guó))。提取的DNA取2 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)?；蚪MDNAOD260/OD280值為1.72～2.01，濃度為40～75 ng/μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示條帶單一，基因組DNA于-80 ℃保存。

表1 ARIX基因、TUBB2b基因、TUBB3基因外顯子引物序列

1.2.2.2引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增ARIX基因、TUBB2b基因及TUBB3基因外顯子區(qū)域。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL模板DNA(10～60 ng/μL)，10 μL Takara 2×PCR Premix(RR003A)，1 μL引物(2.5 pmol/μL)，9 μL ddH2O。使用ABI公司的9700 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。ARIX基因反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，(94 ℃ 45 s ，59 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)×40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min 終止反應(yīng)。TUBB2b基因反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min終止反應(yīng)。TUBB3基因反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶均單一。擴(kuò)增產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物回收試劑盒(OMEGA D2500-01)說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行回收純化。

1.2.3測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖檢測(cè)有目的條帶后，由奧美德諾(北京)基因科技有限公司進(jìn)行切膠純化雙向測(cè)序。測(cè)序PCR的條件為：預(yù)變性96 ℃ 30 s，95 ℃變性 30 s，退火溫度50 ℃ 30 s，60 ℃延伸4 min,25個(gè)循環(huán)后，最后60 ℃延伸5 min，16 ℃結(jié)束反應(yīng)，純化后上3730xl (BigDye Version3.1,美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó))遺傳分析儀器進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNASTAR軟件分析，并與Genebank進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1ARIX基因測(cè)序結(jié)果 與GenBank中公布的人野生型ARIX基因序列比較，本研究篩查的家系中患者2、3、4、5號(hào)在ARIX基因熱點(diǎn)突變區(qū)域NM_005169.3:c.156C>T (p.Leu52=);c.215C>T (p.Ala72Val);c.217+19C>A沒(méi)有出現(xiàn)突變，見(jiàn)圖2。

圖2 ARIX基因熱點(diǎn)突變區(qū)域突變情況

2.2TUBB2b基因測(cè)序結(jié)果 與GenBank中公布的人野生型TUBB2b基因序列比較，本研究篩查的家系中2號(hào)患者在TUBB2b基因外顯子rs2259136位點(diǎn)發(fā)生同義突變，見(jiàn)圖3。

圖3 TUBB2b 基因外顯子rs2259136位點(diǎn)基因型

2.3TUBB3基因測(cè)序結(jié)果 與GenBank 中公布的人野生型TUBB3基因序列比較，本研究篩查的家系中2、4、5號(hào)患者在TUBB3基因3′UTR rs1135425位點(diǎn)存在基因突變，見(jiàn)圖4。

圖4 TUBB3基因3′UTR rs1135425位點(diǎn)基因型

3 討 論

共同性外斜視是一種常見(jiàn)的斜視類(lèi)型，早期表現(xiàn)為外隱斜、間歇性外斜視，最后發(fā)展為恒定性外斜視。常發(fā)病于幼兒，早期表現(xiàn)不容易被家長(zhǎng)所識(shí)別，一旦外斜視從間歇性轉(zhuǎn)變?yōu)楹愣ㄐ?，即使手術(shù)治療，恢復(fù)雙眼單視與立體式的可能性也較小。臨床上常見(jiàn)的治療方式是手術(shù)治療，許多患兒因?yàn)槎喾N原因發(fā)展到恒定性外斜視時(shí)才接受手術(shù)治療，嚴(yán)重影響視功能。因此，對(duì)共同性外斜視的發(fā)病機(jī)制的研究至關(guān)重要。

共同性外斜視具有遺傳性，國(guó)外有研究提出了一些敏感性位點(diǎn)，但無(wú)明確的基因定位，日本學(xué)者調(diào)查了55個(gè)共同性斜視家庭(n=258)，進(jìn)行全基因MOD評(píng)分法分析，發(fā)現(xiàn)在一些敏感染色體4q28.3和7q31.2位點(diǎn)區(qū)域，有來(lái)源于父親或母親的遺傳現(xiàn)象[5]。GONG等[6]通過(guò)研究一對(duì)母女都患有間歇性外斜視的患者，在配對(duì)基因PAX3中發(fā)現(xiàn)了1種新的雜合突變(c.G434T)。ZHANG等[7]研究表明MGST2和WNT2是日本患者共同性外斜視敏感性的候選基因。

共同性外斜視發(fā)病有家族聚集性特點(diǎn)，LEE等[8]研究發(fā)現(xiàn)在兄弟姐妹中有一對(duì)患有斜視時(shí)，共同性外斜視的發(fā)病年齡、屈光狀態(tài)、臨床特征、斜視的亞型都是相同的，也證明了共同性外斜視的遺傳特性。MATSUO等[9]研究孿生兄弟或姐妹患有共同性斜視病例中，單卵雙生子或三胞胎斜視表現(xiàn)一致性最常見(jiàn)，達(dá)84%，雙卵雙生或多卵三胞四胞胎的斜視表現(xiàn)一致性較低，其中間歇性外斜視為主要表現(xiàn)形式。

研究表明共同性外斜視的遺傳是一個(gè)多因素方式，包括遺傳和環(huán)境因素，最主要的危險(xiǎn)因素有早產(chǎn)兒、低出生體質(zhì)量、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、母親孕期吸煙、遠(yuǎn)視和屈光參差、遺傳因素等[10]。BAGHERI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，近親結(jié)婚發(fā)生共同性外斜視比例比非近親結(jié)婚高。

CFEOM是一種少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性眼肌疾病，臨床上主要表現(xiàn)為動(dòng)眼神經(jīng)缺陷引起的斜視。趙堪興[12]提出CFEOM的發(fā)生和KIF21A這種驅(qū)動(dòng)蛋白不能輸送動(dòng)眼神經(jīng)軸突、神經(jīng)肌肉接頭和眼外肌發(fā)育所需物質(zhì)有關(guān)，這種斜視是由支配眼球運(yùn)動(dòng)的顱神經(jīng)發(fā)育異常導(dǎo)致。OUYANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)共同性外斜視患者大腦的幾個(gè)區(qū)域腦白質(zhì)體積明顯降低，動(dòng)眼神經(jīng)傳導(dǎo)異常。2007年劉桂香等[14]發(fā)現(xiàn)共同性外斜視的1個(gè)突變基因——ARIX基因位于染色體11q13上，由3個(gè)外顯子組成，編碼1個(gè)同源結(jié)構(gòu)域翻譯因子，對(duì)交感神經(jīng)和與眼位控制有關(guān)的腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元亞群的傳代和生存起關(guān)鍵作用。本研究這個(gè)家族性共同性外斜視家系，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)患者有ARIX基因外顯子的任何突變。

ARIX基因突變與CFEOM2有關(guān)，CFEOM表現(xiàn)為先天性上瞼下垂和外斜視，外斜視眼球運(yùn)動(dòng)受限可能是由于在運(yùn)動(dòng)蛋白KIF21A或tubulin等類(lèi)型的TUBB3或TUBB2b中雜合子錯(cuò)義突變引起的[15]。這些基因突變會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和引導(dǎo)缺陷。日本學(xué)者 NAKANO等[16]通過(guò)研究4個(gè)CFEOM2家系,對(duì)這些家族成員進(jìn)行基因測(cè)序和突變篩查,發(fā)現(xiàn)該家系A(chǔ)RIX/PHOX 2 A 基因的3個(gè)純合子突變與發(fā)病密切相關(guān)。CFEOM的3種遺傳形式被定義為CFEOM1、CFEOM2和CFEOM3。CFEOM2是一種由轉(zhuǎn)錄因子PHOX2A中純合突變引起的神經(jīng)元規(guī)范的常染色體隱性障礙，而CFEOM1和CFEOM3是軸突誘導(dǎo)的常染色體顯性障礙，分別由KIF21A和TUBB3或TUBB2b的雜合突變引起[17]。

通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)本研究這個(gè)家系患者的TUBB2b 基因的外顯子，發(fā)現(xiàn)2號(hào)患者在rs2259136位點(diǎn)有同義突變，雖并未引起氨基酸改變，但該位點(diǎn)rs2259136首次在共同性外斜視患者中發(fā)現(xiàn)，其意義值得進(jìn)一步研究。本家系中2、4、5號(hào)3例共同性外斜視患者，在TUBB3基因中發(fā)現(xiàn)3′UTR區(qū)域rs1135425位點(diǎn)突變，3′UTR具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，可與miRNA或RNA結(jié)合影響mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，本研究推斷3′UTR區(qū)域rs1135425位點(diǎn)改變可能是引起該家系外斜視的病因。

對(duì)于共同性外斜視遺傳性來(lái)說(shuō)，闡明特定的基因突變?nèi)匀皇且粋€(gè)巨大的挑戰(zhàn)，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其遺傳性是由遺傳和環(huán)境多因素影響的。隨著新興的基因組測(cè)序工具的使用，學(xué)界可能會(huì)產(chǎn)生新的見(jiàn)解，現(xiàn)在斜視的遺傳性研究也開(kāi)始有從研究斜視肌肉分子組成、調(diào)控基因表達(dá)方向進(jìn)行的，AGARWAL等[18]研究發(fā)現(xiàn)斜視肌的分子組成發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的改變。未來(lái)還會(huì)有更多新的研究方向產(chǎn)生，本研究發(fā)現(xiàn)的基因突變位置可能是未來(lái)研究的基礎(chǔ)，了解這些基因突變的作用有助于了解目前尚不清楚的發(fā)病機(jī)制，這也是本課題組臨床研究工作開(kāi)展的目的。