外周血Th17細(xì)胞對(duì)大劑量地塞米松治療免疫性血小板減少癥長(zhǎng)期療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

李顥，姜海華，王新偉

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是臨床最為常見(jiàn)的出血性疾病，其主要發(fā)病機(jī)制是由于病人對(duì)自身抗原的免疫失耐受，導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的血小板破壞增多和巨核細(xì)胞產(chǎn)血小板障礙[1]。阻止血小板過(guò)度破壞和促進(jìn)血小板生成是治療ITP的兩個(gè)重要方面。糖皮質(zhì)激素是治療ITP的主要藥物，由于長(zhǎng)期服用潑尼松的不良反應(yīng)發(fā)生率高，目前關(guān)于ITP的專家共識(shí)把短療程、大劑量地塞米松(dexamethasone,DXM)放在常規(guī)劑量潑尼松之前進(jìn)行推薦[2]。盡管短療程、大劑量的DXM方案能取得更高的治療反應(yīng)率及更短的達(dá)反應(yīng)時(shí)間，但停止治療6個(gè)月后仍有約50%的治療反應(yīng)者再次復(fù)發(fā)[3-4]。因此，篩選大劑量DXM遠(yuǎn)期療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)有助于對(duì)潛在的復(fù)發(fā)病人進(jìn)行早期干預(yù)。Th17細(xì)胞是分泌IL-17等細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞亞群，多項(xiàng)研究表明ITP病人外周血Th17細(xì)胞比例增高，并與ITP的發(fā)病密切相關(guān)[5-7]。本研究通過(guò)檢測(cè)大劑量DXM治療前ITP病人外周血Th17細(xì)胞比例，探討Th17細(xì)胞在預(yù)測(cè)短療程、大劑量DXM長(zhǎng)期療效中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1臨床資料2015年2月至2016年8月汝南縣人民醫(yī)院收治的原發(fā)初診ITP病人42例，診斷依據(jù)文獻(xiàn)[1]，并排除其他繼發(fā)性疾病。男20例，女22例；中位年齡36歲(18～58)歲；中位血小板計(jì)數(shù)(PLT)12×109/L [(1～35)×109/L]。本研究得到汝南縣人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人或其近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書(shū)。

1.2治療方案連續(xù)口服DXM 4 d，每天40 mg，不進(jìn)行維持治療；如停止治療1周后PLT仍低于30×109/L，或仍有出血癥狀，再予DXM (40 mg/d)，口服4 d。

1.3療效判斷標(biāo)準(zhǔn)完全反應(yīng)(Complete response,CR)定義為治療后PLT ≥ 100×109/L且無(wú)出血癥狀；有效(Response,R)定義為治療后PLT ≥ 30×109/L且至少為基礎(chǔ)PLT的2倍，同時(shí)無(wú)出血癥狀；無(wú)效(No response,NR)定義為治療后PLT<30×109/L或PLT不到基礎(chǔ)值的2倍或仍有出血癥狀；持續(xù)反應(yīng)(Sustained response,SR)定義為取得治療反應(yīng)后6個(gè)月內(nèi)PLT≥ 30×109/L且無(wú)出血癥狀。

1.4試劑與儀器胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；佛波酯、離子霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，布雷菲德菌素A購(gòu)自美國(guó)Alexis公司；PE-Cy7標(biāo)記的抗人CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗人CD8抗體、PE標(biāo)記的抗人IL-17A抗體、Cytofix/Cytoperm試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司；FACSCanto Ⅱ 型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.5Th17細(xì)胞比例測(cè)定采集治療前的ITP病人空腹靜脈血5 mL，肝素抗凝，于無(wú)菌條件下采用密度梯度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞密度為4×106/mL。取單個(gè)核細(xì)胞懸液1 mL加入24孔培養(yǎng)板，再依次加入佛波酯、離子霉素和布雷菲德菌素A，使其終濃度分別為50 ng/mL、1 μg/mL、3 μg/mL，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4 h。收集細(xì)胞，加入PE-Cy7標(biāo)記的CD3抗體和FITC標(biāo)記的CD8抗體各10 μL，避光孵育15 min；然后按照Cytofix/Cytoperm試劑盒說(shuō)明書(shū)固定、破膜，加入PE標(biāo)記的IL-17A抗體孵育30 min，最后用PBS洗滌細(xì)胞2遍后上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算CD3+CD8-IL-17A+細(xì)胞(Th17細(xì)胞)占CD3+CD8-T細(xì)胞的比例。

2 結(jié)果

2.1ITP病人的臨床療效42例初診ITP病人接受大劑量DXM治療后，CR 20例(47.6%)，R 13例(31%)，NR 9例(22.4%)。33例取得治療反應(yīng)的病人(CR+R)中，SR 15例(45.45%)，6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)18例(54.55%)。

2.2ITP病人外周血Th17細(xì)胞比例與大劑量DXM長(zhǎng)期療效的關(guān)系比較治療前外周血Th17細(xì)胞比例在SR組病人與復(fù)發(fā)組病人之間的差異，如圖1、圖2所示，復(fù)發(fā)組 (Relapse) Th17細(xì)胞比例顯著高于SR組[(1.50±0.46)% 比 (0.93±0.24)%，P<0.01]。

圖1 ITP病人外周血Th17細(xì)胞比例與大劑量DXM長(zhǎng)期療效的關(guān)系

注：Th17細(xì)胞群(灰色)為CD3+CD8-IL-17A+，A為1例SR病人流式圖，B為另外1例SR病人流式圖

圖2代表性Th17細(xì)胞流式分析圖

2.3ITP病人外周血Th17細(xì)胞比例對(duì)大劑量DXM長(zhǎng)期療效的預(yù)測(cè)價(jià)值由于ITP病人初診時(shí)外周血Th17細(xì)胞比例與大劑量DXM的長(zhǎng)期療效有關(guān)，進(jìn)一步采用ROC評(píng)價(jià)Th17細(xì)胞比例是否有助于判斷大劑量DXM的長(zhǎng)期療效。如圖3所示，初診時(shí)Th17細(xì)胞比例預(yù)測(cè)大劑量DXM長(zhǎng)期療效的曲線下面積(AUC)為0.857(95%CI0.717～0.998，P<0.01)，cut-off值為1.235%，此時(shí)敏感性為77.8%，特異性為93.3%。

圖3 外周血Th17細(xì)胞比例對(duì)大劑量DXM長(zhǎng)期療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增多是ITP的主要致病機(jī)制。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明失調(diào)的細(xì)胞免疫也參與ITP的發(fā)生發(fā)展，如ITP病人外周血存在Th1/Th2及Th17/Treg細(xì)胞比例失衡[8]。Th17細(xì)胞分泌特征性的促炎細(xì)胞因子IL-17，而在包括ITP在內(nèi)的多種自身免疫性疾病病人外周血中Th17細(xì)胞及IL-17水平升高[7,9-10]。Yoh等[11]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功構(gòu)建Th17細(xì)胞上調(diào)的小鼠模型，觀察到Th17細(xì)胞比例上調(diào)可促進(jìn)抗血小板自身抗體產(chǎn)生。

糖皮質(zhì)激素是初治ITP病人的一線治療方案，研究表明短療程、大劑量的DXM方案較長(zhǎng)療程、常規(guī)劑量的潑尼松方案有更高的治療反應(yīng)率，且感染、高血糖、高血壓等不良反應(yīng)發(fā)生率低于強(qiáng)的松方案[4]。在本研究中，初治ITP病人對(duì)大劑量DXM的總體反應(yīng)率(CR+R)為78.6% (33/42)，6個(gè)月后仍有45.5%(15/33)的病人維持治療反應(yīng)，與既往研究結(jié)果基本一致[3-4]。大劑量DXM可校正ITP病人外周血中失調(diào)的Th17/Treg細(xì)胞比例[12]，提示下調(diào)Th17細(xì)胞是DXM治療ITP的途徑之一。筆者觀察到，對(duì)大劑量DXM持續(xù)反應(yīng)的ITP病人初診時(shí)外周血Th17細(xì)胞比例低于取得治療反應(yīng)但6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)的ITP病人，表明治療前外周血Th17細(xì)胞比例與DXM的長(zhǎng)期療效有關(guān)。采用ROC進(jìn)一步評(píng)價(jià)Th17細(xì)胞比例對(duì)大劑量DXM長(zhǎng)期療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示曲線下面積為0.87(P<0.01)，表明初診時(shí)外周血Th17細(xì)胞比例有助于預(yù)測(cè)大劑量DXM的長(zhǎng)期療效。

當(dāng)然，本研究也存在一些局限性，一是納入的樣本量偏少，統(tǒng)計(jì)效率相對(duì)較低；二是多數(shù)ITP病人的隨訪時(shí)間截止到取得治療反應(yīng)后的6個(gè)月，無(wú)法評(píng)價(jià)Th17細(xì)胞比例對(duì)大劑量DXM方案更長(zhǎng)療效的預(yù)測(cè)價(jià)值。因此，尚需大樣本的病例研究和更長(zhǎng)的隨訪時(shí)間予以證實(shí)。