一個(gè)蘋果β-微管蛋白基因及其啟動(dòng)子序列特征分析

張海月，肖玉雄，田義軻，王彩虹，楊紹蘭，李 昱，李玉琪

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

蘋果樹體形狀一般分為柱型、短枝型、普通型和下垂型，其中柱型的矮化程度最高，表現(xiàn)為節(jié)間短、腋芽萌發(fā)產(chǎn)生大量短側(cè)枝，很少或無側(cè)生延長新梢，冠形極其緊湊，非常適合高密度種植。因此，該性狀形成的機(jī)制一直是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

微管是細(xì)胞骨架的重要組成成分，是由亞單位α/β微管蛋白(α/β-tubulin)異二聚體形成原絲，然后裝配成中空的管狀結(jié)構(gòu)[1]。微管對(duì)植物的正常生長發(fā)育具有重要作用，主要參與了植物細(xì)胞生長的關(guān)鍵過程，包括細(xì)胞的分裂和形態(tài)建成[2-3]。例如，微管的聚集能夠促進(jìn)植物頂端的生長[4]，通過調(diào)節(jié)纖維素微纖維的沉積方向參與細(xì)胞壁的形成過程，影響細(xì)胞壁的組分和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞的伸長[5-7]。微管還影響被子植物花粉管的生長[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，植物體中微管的減少、變短和分離都能導(dǎo)致植株的矮化[9]。微管還廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生物和非生物脅迫[10-11]，并對(duì)維持高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的形態(tài)和功能具有重要作用[12-13]。

植物中的微管蛋白氨基酸序列相似性極高[14]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)[15]、毛果楊(PopulustrichocarpaTorr.&Gray)[16]、玉米(ZeamaysL.)[17-18]、水稻(OryzasativaL.)[19]、梨(Pyrusspp.)[20]、亞麻 (LinumusitatissimumL.)[21]、柳(SalixbabylonicaL.)[22-23]等植物上已報(bào)道了大量的微管蛋白基因。目前，蘋果上還未見有關(guān)微管蛋白基因的報(bào)道。

前期研究中，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹育種課題組從西洋梨基因組中鑒定了一組β-微管蛋白基因，有7個(gè)基因在莖尖組織中表達(dá)。其中，定位于chr16上的轉(zhuǎn)錄本號(hào)為PCP044487.1的基因在矮生型和普通型梨莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著，推測(cè)該基因可能與梨矮生性狀形成的分子調(diào)控有關(guān)[20]。在蘋果基因組中搜索發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄本號(hào)為MDP0000749824.1的蛋白與PCP044487.1相似性最高。本研究欲以柱型蘋果品種舞姿和普通型蘋果品種煙富3號(hào)為代表，探討該基因在這2種不同株型上的表達(dá)特征，同時(shí)，對(duì)該基因及其啟動(dòng)子序列特征進(jìn)行分析，為進(jìn)一步深入研究該基因的功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

2017年5月中旬，在田間選取5年生的普通型蘋果品種煙富3號(hào)和柱型蘋果品種舞姿各3株(即3次重復(fù))，基砧均為八棱海棠，選取旺盛生長的梢端組織(長度約為0.5 cm)，投入液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取幼嫩的本氏煙草葉片用于亞細(xì)胞定位研究。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 采用北京原平皓生物技術(shù)有限公司的EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取莖尖總RNA。采用Fermentas公司的RevertAid First-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體步驟參考試劑盒說明書。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋20倍用于qRT-PCR分析。

1.2.2MDP0000749824.1基因在2個(gè)不同株型蘋果品種莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平分析 從蘋果基因組數(shù)據(jù)庫(https：//www.rosaceae.org/species/malus/all)序列，據(jù)此設(shè)計(jì)qRT-PCR分析用引物(F：5′-GGTCATGTTTAGGAGGAAGG-3′；R：5′-CCAGCTCTTCCTCATCATAC-3′)。以蘋果Actin(GenBank登錄號(hào)：XM_017335931.1)作為內(nèi)參基因(F：5′-CCAAAGGCTAATCGGGAGAAA-3′；R：5′-ACTGGCGTAGAGGGAAAGAACA-3′)。引物由上海生工公司合成。轉(zhuǎn)錄水平在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Light Cycler?480Ⅱ(Roche)上分析。qRT-PCR采用10 μL體系，包含1×LightCycler 480 Green Ⅰ Master(Roche)5.0 μL、模板cDNA 1.0 μL、正、反向引物(0.25 μmol/L)各0.5 μL、2.0 mmol/L MgCl23.0 μL。反應(yīng)條件是95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，先升溫至95 ℃ 5 s，再降溫至65 ℃ 1 min，然后升溫到97 ℃。在65～97 ℃的升溫過程中收集熒光(每變化0.2 ℃收集1次熒光)。待溫度冷卻至40 ℃終止反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。使用2-ΔΔCt方法[24]對(duì)熒光值的變化曲線進(jìn)行分析，計(jì)算目的片段的轉(zhuǎn)錄水平。用SPSS軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。

1.2.3MDP0000749824.1基因CDS序列克隆及特征分析 根據(jù)下載的CDS序列信息設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物(F：5′-ATGAGAGAAATCTTGCAC-3′；R：5′-TCAGTTCTCCAGCTCTTCCT-3′)，以煙富3號(hào)、舞姿莖尖RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；然后依次進(jìn)行95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；最終在72 ℃下終延伸10 min。從1%的瓊脂糖凝膠上用試劑盒Agrose Gel DNA Recovery Kit Ver.2.0(TaKaRa)回收目的基因。將回收產(chǎn)物連接到pMD?18-T Simple Vector載體上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，然后進(jìn)行測(cè)序，以獲取該基因的全長CDS序列。用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫Apple Gene Set(https：//www.rosaceae.org/species/malus/all)中搜索該基因序列，分析其外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并進(jìn)行相應(yīng)的染色體定位。

1.2.4 MDP0000749824.1蛋白理化性質(zhì)及其進(jìn)化分析 用在線軟件Protparam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性質(zhì)；用SOMPA(http：//www.expasy.ch/tools)和Phyre2在線軟件(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)對(duì)蛋白二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；將MDP0000749824.1與NCBI中提交的梨、桃、油菜、擬南芥、水稻、高粱和玉米等物種的β-微管蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，使用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 MDP0000749824.1蛋白亞細(xì)胞定位 利用得到的蘋果MDP0000749824.1全長CDS序列，通過引物(Up-5′-GGATCCATGGGGAGGGGAAAG/CCCAAGATGAAGGGCCGT-3′-Dn)引入酶切位點(diǎn)KpnⅠ和XbaⅠ，以煙富3號(hào)蘋果cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃變性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用Agrose Gel DNA Recovery Kit Ver.2.0(TaKaRa)膠回收試劑盒回收目的條帶。用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切Cam35S-GFP空載體后，將所回收的目的片段和Cam35S-GFP空載體用重組連接酶連接，獲得Cam35S-MDP0000749824-GFP重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Amp+)后進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，挑取陽性菌落用于測(cè)序驗(yàn)證。將融合載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，在幼嫩的煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。使用激光共聚焦顯微鏡FV10-ASW(OLYMPUS)觀察綠色熒光定位情況。

1.2.6 啟動(dòng)子克隆及序列分析 采用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根)提取基因組DNA。在蘋果基因組中截取MDP0000749824.1基因編碼序列上游約1 600 bp的參考序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物(F：5′-ACTTATCTGGAAATCACGCTCTT-3′；R：5′-GTTCCCACATTGTCCAG-3′)。分別以舞姿和煙富3號(hào)的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序和后續(xù)的克隆轉(zhuǎn)化以及測(cè)序分析等同1.2.3。利用在線軟件PlantCare(http：//bioinformatics.Psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDP0000749824.1在2個(gè)具有不同株型蘋果品種莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析檢測(cè)結(jié)果表明，MDP0000749824.1在柱型蘋果品種舞姿莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于普通型蘋果品種煙富3號(hào)，后者約是前者的3.8倍(圖1)。

T.舞姿(柱型)；YF3.煙富3號(hào)(普通型)；不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。圖7同。T.Telamon(Colummar type)；YF3.Yanfu 3(Standard type)；Different lowercase letters mean significant difference at P≤0.05.The same as Fig.7.

2.2 MDP0000749824.1基因結(jié)構(gòu)與染色體定位

以柱型蘋果品種舞姿及普通型蘋果品種煙富3號(hào)新梢莖尖組織cDNA為模板，經(jīng)MDP0000749824.1 CDS特異性引物PCR擴(kuò)增后，均獲得一段1 332 bp核苷酸序列。在蘋果基因組中搜索發(fā)現(xiàn)，該基因位于16號(hào)染色體上(Chr16：16834724-16836980)(圖2)，整個(gè)基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子(圖3)。DNAMAN比對(duì)結(jié)果表明，煙富3號(hào)和舞姿上該基因的編碼序列完全一致。

2.3 MDP0000749824.1蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

MDP0000749824.1基因編碼一個(gè)含有443個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有植物β-微管蛋白的保守序列，包括微管蛋白GTP結(jié)合位點(diǎn)片段GGGTGSG和磷酸化位點(diǎn)片段MREI(圖4)。

圖2 MDP0000749824.1在蘋果基因組中染色體上的位置Fig.2 Chromosome position of MDP0000749824.1 in apple genome

在線軟件ProtParam分析顯示，MDP0000749824.1編碼蛋白的分子式為C2192H3371N597O676S33，蛋白分子質(zhì)量為49.96 ku，等電點(diǎn)pI為4.90，其中包含帶正電殘基(Arg+Lys)36個(gè)，帶負(fù)電殘基(Asp+Glu)57個(gè)。進(jìn)一步分析表明，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為31.74，脂肪系數(shù)為71.06，平均親水性系數(shù)為-0.349。MDP0000749824.1蛋白親水性分析發(fā)現(xiàn)，其C端偏向疏水性，N端偏向親水性，親水性與疏水性交替出現(xiàn)在該蛋白的中間部分，其中，達(dá)-2.0以下的親水峰有9處，達(dá)2.0以上的疏水峰有2處。

數(shù)字代表堿基數(shù)量。 Numbers represent the base length.

圖4 MDP0000749824.1基因編碼的氨基酸序列Fig.4 Amino acid sequence encoded by gene MDP0000749824.1

利用SOPMA在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，MDP0000749824.1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋所占比例最大，為39.50%；不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)次之，比例為29.12%；β轉(zhuǎn)角最少，僅為11.29%。用Phyre2預(yù)測(cè)MDP0000749824.1的三級(jí)結(jié)構(gòu)的覆蓋度為96%。

2.4 MDP0000749824.1蛋白亞細(xì)胞定位

克隆MDP0000749824.1全長CDS序列，構(gòu)建了Cam35S-MDP0000749824.1-GFP融合載體，并將其轉(zhuǎn)入煙草葉片上皮細(xì)胞中，激光共聚焦顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示，該蛋白定位在細(xì)胞膜和微管中(圖5)。

UV.綠色通道；DIC.明場(chǎng)通道；Merge.綠色和明場(chǎng)重疊通道；1.Cam35S-MDP0000749824.1-GFP煙草上皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)；2.空白對(duì)照。UV.Green channel；DIC.Bright field channel；Merge.Overlays of green and bright field channel；1.Transient expression of Cam35S-MDP0000749824.1-GFP fusion protein in tobacco epidermis cells；2.Postive control.

2.5 蛋白序列進(jìn)化分析

將來自不同物種的高度同源的26條蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋果的MDP0000749824.1與白梨(XP 009364903.1)、梅(XP 008220629.1)、碧桃(XP 007211186.1)等薔薇科木本植物的相似性較大，而與玉米(NP 001167651.1)、水稻(pir||JC2510)、高粱(XP 002456503.2)、小立碗蘚(XP 001767462.1)、擬南芥(NP 196786.1)等非木本植物的相似性較低(圖6)。

圖6 蘋果MDP0000749824.1與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic relationship among MDP0000749824.1 and other homologous proteins

2.6 啟動(dòng)子序列比對(duì)與順式作用元件分析

分別以舞姿及煙富3號(hào)的DNA為模板，用啟動(dòng)子特異性引物PCR擴(kuò)增后，均獲得一段1 661 bp的核苷酸序列，二者有6處堿基差異(圖7)。通過Neural Network Promoter Prediction軟件(http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在線預(yù)測(cè)該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為翻譯起始密碼子上游700 nt的A堿基。序列中除存在多數(shù)啟動(dòng)子具有的基本轉(zhuǎn)錄元件外，還發(fā)現(xiàn)了一些順式調(diào)控元件，如赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯和水楊酸等激素響應(yīng)元件，分生組織表達(dá)相關(guān)順式調(diào)控元件和光調(diào)控元件等(表1)。然而，這6處差異均不在預(yù)測(cè)的調(diào)控元件位置。

方框內(nèi)代表啟動(dòng)子上的順式作用元件；TSS.轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；M.起始密碼子。The boxes represent the promoter cis-acting elements.TSS.Transcription start site；M.Start codon.

元件Motif位置(±鏈)Distance from ATG(±strand)元件序列Motif sequence功能Function5′UTR Py-rich stretch1 379(+)1 402(+)TTTCTTCTCTTTTCTTCTCT高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件ABRE902(-)904(-)CGTACGTGCATACGTGABA響應(yīng)順式作用元件AE-box434(-)AGAAACAT部分光響應(yīng)模塊ARE398(-)TGGTTT厭氧誘導(dǎo)必需的順式作用調(diào)控元件ATCT-motif214(+)AATCTAATCT光調(diào)控元件Box 4353(+)967(-)ATTAATATTAAT光調(diào)控元件Box Ⅰ237(-)TTTCAAA光響應(yīng)元件CAT-box1 235(+)GCCACT分生組織表達(dá)相關(guān)順式調(diào)控元件CATT-motif558(-)GCATTC部分光響應(yīng)元件CGTCA-motif520(+)CGTCA茉莉酸甲酯響應(yīng)順式調(diào)控元件G-Box904(+)904(-)CACGTA參與光響應(yīng)順式作用調(diào)控元件GAG-motif153(+)264(-)GGAGATGAAACAGA光調(diào)控元件GARE-motif1 014(+)299(-)AAACAGAAAACAGA赤霉素響應(yīng)元件GT1-motif359(-)693(-)GGTTAAGGTTAA光調(diào)控元件HSE279(+)AAAAAATTTC熱脅迫響應(yīng)順式作用元件I-box630(-)GATATGG光調(diào)控元件LAMP-element1 196(+)CCTTATCCA光調(diào)控元件MBS828(+)CAACTG參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)Skn-1-motif772(+)1 014(-)929(+)1 146(-)GTCATGTCATGTCATGTCAT胚乳表達(dá)必需的順式作用調(diào)控元件TATC-box987(-)1 135(-)TATCCCATATCCCA赤霉素響應(yīng)順式調(diào)控元件TC-rich repeats801(-)ATTTTCTTCA防御與脅迫響應(yīng)順式作用元件TCA-element1 378(-)GAGAAGAATA參與水楊酸響應(yīng)順式作用元件TGACG-motif520(-)TGACG茉莉酸甲酯響應(yīng)順式調(diào)控元件Unnamed_2178(-)AACCTAACCTCircadian523(+)CAAGTCAATC晝夜節(jié)律調(diào)控有關(guān)的順式調(diào)控元件

3 討論

柱型蘋果因極其緊湊的生長習(xí)性，非常適合高密度種植。因此，蘋果柱型性狀形成的生理機(jī)制以及分子機(jī)制一直是眾多學(xué)者探討的熱點(diǎn)問題[25-33]。

微管作為細(xì)胞骨架的重要組成，對(duì)植物的生長發(fā)育是有重要影響的。微管蛋白不僅在保持細(xì)胞的形態(tài)方面起支撐作用，而且對(duì)細(xì)胞壁的形成也起到了決定性作用，同時(shí)，還參與了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸。因此，微管蛋白的合成會(huì)直接影響到細(xì)胞的生長與分裂，因而可能會(huì)對(duì)莖的伸長生長造成影響。本試驗(yàn)通過同源克隆的方法獲得了蘋果微管蛋白基因MDP0000749824.1的CDS和啟動(dòng)子序列。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，MDP0000749824.1基因在柱型蘋果品種舞姿莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于普通型蘋果品種煙富3號(hào)。但序列比對(duì)分析表明，這2個(gè)品種中，該基因的編碼序列沒有差異。盡管二者在啟動(dòng)子序列上檢測(cè)到6處堿基差異，但均不在重要調(diào)控元件位置?？梢姡摶虻谋磉_(dá)差異不應(yīng)該是由于兩品種間其特異的序列差異引起的，而極有可能是受到了柱型基因調(diào)控的影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MDP0000749824.1基因啟動(dòng)子序列上存在多個(gè)與脫落酸、赤霉素、茉莉酸甲酯和水楊酸等激素調(diào)節(jié)相關(guān)的元件。前人研究發(fā)現(xiàn)，柱型蘋果莖尖中自由型IAA和CTK的含量明顯高于普通型蘋果，且柱型蘋果莖尖組織中的活性赤霉素含量明顯偏低[34-38]，可見，柱型性狀的形成與激素調(diào)控密切相關(guān)。因此，該基因在2個(gè)品種上的轉(zhuǎn)錄水平差異可能是由2種不同株型間的內(nèi)源激素水平差異導(dǎo)致的。

蘋果柱型性狀產(chǎn)生的根源取決于位于10號(hào)染色體上的Co基因，圍繞該基因的分離鑒定盡管已經(jīng)作了大量的研究[28-29，33]，但目前仍難給出最終的定論。柱型表型應(yīng)該是受Co基因牽動(dòng)的一個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的綜合效應(yīng)。根據(jù)本研究結(jié)果，筆者推測(cè)，β-微管蛋白基因MDP0000749824.1是位于Co調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要成員，Co基因是通過對(duì)內(nèi)源激素的影響，使該微管蛋白的合成受阻，最終影響到了莖的伸長，致使節(jié)間變短，植株矮化。關(guān)于這個(gè)問題，筆者將進(jìn)一步設(shè)計(jì)研究方案，并作進(jìn)一步的深入探討。

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