羊骨膠原肽對(duì)去卵巢大鼠的骨質(zhì)改善作用

原愷，李愛(ài)玲，韓克光，郝在林，程稚玲，陳靜，金淑秀，馬林峰，霍乃蕊*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.古縣畜牧獸醫(yī)局，山西 古縣 042400；3.錫林郭勒盟肽好生物制品有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 錫林郭勒 026000；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

絕經(jīng)婦女因雌激素水平下降易導(dǎo)致骨代謝失衡，進(jìn)而引起骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)，OP是一種以骨量降低、骨礦物質(zhì)比例減少、骨微觀結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨骼脆性增加和易骨折的全身性疾病[1,2]。OP引起的骨折等并發(fā)癥嚴(yán)重影響著中老年婦女的健康，而目前傳統(tǒng)治療OP的方法多為藥物治療，如雌激素，雙磷酸鹽類等，副作用明顯[3]。因此，研發(fā)安全有效的新型OP非藥物防治制劑非常有必要。

我國(guó)的畜禽骨資源豐富，而且骨的營(yíng)養(yǎng)成分很多[4]。畜骨提取的膠原蛋白中存在很多有生物活性的小分子肽段，且更易被吸收，有研究顯示骨酶解得到的骨膠原肽可能對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)有一定作用[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)通過(guò)酶解羊骨成功制備了羊骨膠原肽(collagen peptide，CP)，并證實(shí)了CP對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)作用[6,7]，但對(duì)于羊骨膠原肽對(duì)雌激素缺乏導(dǎo)致的疏松骨質(zhì)的效果尚未研究。

臨床上能反映骨質(zhì)情況的指標(biāo)包括骨密度、骨礦物質(zhì)及骨有機(jī)質(zhì)含量[8～10]，血清中PINP和β-CTx是骨代謝標(biāo)志物，其水平能客觀反應(yīng)骨代謝情況[11]。而目前對(duì)于OP的研究大多采用成年雌性大鼠雙側(cè)卵巢摘除的骨質(zhì)疏松模型[12]。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型，并檢測(cè)CP對(duì)去卵巢大鼠骨密度，骨礦物質(zhì)及骨有機(jī)質(zhì)含量以及血清中PINP和β-CTx的水平的影響，探討CP對(duì)去卵巢大鼠疏松骨質(zhì)的作用，為人和動(dòng)物OP的防治提供新的、更加安全有效的制劑以及為畜骨資源的高值利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

CP購(gòu)于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟肽好生物制品有限責(zé)任公司。17β-雌二醇購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，PINP、β-CTx酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)于伊萊瑞特生物科技有限公司，羥脯氨酸試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。乙醚、生理鹽水、無(wú)水乙醇等均為分析純。

火焰原子吸收分光光度計(jì)(WDF-Y2，英國(guó)Stevens公司)，箱式電阻爐(SX-12-10，上海實(shí)驗(yàn)電爐廠)，多功能酶標(biāo)儀(SPectraMax M5，Molecular Devices公司)。

1.2 試驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物與分組處理

選取體重(203±20)g的10周齡雌性SD大鼠48只。大鼠和基礎(chǔ)飼料由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(晉)2015-0001】提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)取40只大鼠手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，剩余大鼠做為假手術(shù)組(SHAM)切除卵巢附近等重量的脂肪，其中切卵巢大鼠中隨機(jī)取8只作為模型組(OVX)。手術(shù)后大鼠，給予正常進(jìn)食和飲水，在(23±2)℃下，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，SHAM組與OVX組正常喂食。剩余切卵巢大鼠隨機(jī)分組(n=8)：羊骨膠原肽的高中低劑量組(CP-H、CP-M、CP-L)每天分別灌胃CP(3.4，2.05，0.68 g·kg-1)，以上處理9周后處死大鼠。上述所有動(dòng)物操作均根據(jù)“中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南”進(jìn)行，試驗(yàn)試驗(yàn)方案經(jīng)動(dòng)物科學(xué)與獸醫(yī)學(xué)院倫理與福利委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 骨密度、骨礦物質(zhì)及羥脯氨酸含量的測(cè)定

大鼠處死后，剝離雙側(cè)股骨，剔除雜肉后稱重(M)，用排水法測(cè)定體積(V)，按M/V計(jì)算骨密度。再測(cè)定其中的骨礦物質(zhì)和羥脯氨酸含量：取大鼠左側(cè)股骨，稱重，磨碎，進(jìn)行灰化，時(shí)間為2 h。取出骨灰，用硝酸溶解，經(jīng)處理后用火焰原子吸收分光光度計(jì)來(lái)進(jìn)行Ca、Mg、Mn、Zn的測(cè)定[13]。羥脯氨酸含量的測(cè)定參考南京建成羥脯氨酸測(cè)試盒說(shuō)明書。

1.4 血液PINP及β-CTx水平測(cè)定

采用雙抗體夾心的ELISA法測(cè)定血液中PINP，將標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為4 000 pg·mL-1)進(jìn)行倍比稀釋，稀釋濃度分別為：4 000、2 000、1 000、500、250、62.5、0 pg·mL-1，在450 nm下，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋濃度對(duì)應(yīng)的OD450值。以標(biāo)準(zhǔn)品大鼠PINP濃度為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完成后，取分裝的血清樣品，參照ELISA試劑盒的使用說(shuō)明，測(cè)得對(duì)應(yīng)的OD450值，根據(jù)測(cè)得的OD450值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程，計(jì)算實(shí)際樣品中的PINP濃度。

采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定血液中β-CTx，參照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定，首先以大鼠標(biāo)準(zhǔn)品β-CTx系列濃度為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取分裝的血清樣品進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)OD450值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程，計(jì)算實(shí)際樣品中的β-CTx濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 CP對(duì)去卵巢大鼠股骨密度的影響

由圖1可見(jiàn)，OVX組大鼠股骨密度顯著低于SHAM組，證明大鼠去卵巢后股骨密度顯著降低，去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。CP各劑量組及E2組大鼠股骨密度顯著高于OVX組，但均顯著低于SHAM組，其中CP中劑量組股骨密度顯著高于低劑量組和高劑量組(P<0.05)，表明CP可以抑制去卵巢大鼠股骨密度的降低。

圖1 CP對(duì)去卵巢大鼠股骨密度的影響Fig.1 Effect of CP on femur density in ovariectomized rats注：不同字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。Note:Different letters show significant difference at the 0.05 level.The same below.

2.2 CP對(duì)去卵巢大鼠骨礦物質(zhì)含量的影響

由圖2可以看出，OVX組大鼠骨礦物質(zhì)Ca、Mg、Zn、Mn的含量均顯著低于SHAM組(P<0.05)，表明大鼠去除卵巢后股骨礦物質(zhì)的含量顯著流失；而CP各劑量組與E2組大鼠骨礦物質(zhì)含量均顯著高于OVX組(P<0.05)，因此CP可以有效抑制去卵巢大鼠骨礦物質(zhì)的流失。

2.3 CP對(duì)去卵巢大鼠股骨中羥脯氨酸含量的影響

由圖3可知，OVX組大鼠股骨中羥脯氨酸含量顯著低于SHAM組，大鼠去除卵巢后骨有機(jī)質(zhì)羥脯氨酸含量顯著降低，CP各劑量組與E2組大鼠股骨中羥脯氨酸含量顯著高于OVX組，CP各劑量組中CP-M組的羥脯氨酸含量最高(P<0.05)，因此CP可以有效抑制羥脯氨酸的流失。

2.4 CP對(duì)去卵巢大鼠血清PINP和β-CTx水平的影響

以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程分別為：

yPINP=3.242(1-exp(-0.001x)；

yβ-CTx=(0.275+0.002x)^(-1/1.711)。

根據(jù)上述擬合方程，計(jì)算各組大鼠血清中PINP和β-CTx的含量，由表1可知，OVX組大鼠血清中的PINP和β-CTx含量均顯著高于SHAM組，CP各劑量組與E2組大鼠血清中的PINP和β-CTx含量均顯著低于OVX組(P<0.05)且CP-L組與SHAM組差異不顯著(P>0.05)。因此CP可以有效降低去卵巢大鼠血清中PINP和β-CTx含量。

3 討論與結(jié)論

雌激素是維持骨代謝平衡的重要因素[14]，大鼠切除卵巢后，體內(nèi)雌激素水平降低，骨吸收大于骨形成，進(jìn)而導(dǎo)致OP的發(fā)生。因此常用切除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松模型。目前臨床上以骨密度減少作為判斷OP發(fā)生的主要標(biāo)準(zhǔn)[15]。PINP為I型前膠原氨基端前肽，β-CTx為I型膠原分解的產(chǎn)物，OP發(fā)生時(shí)，骨代謝加快，骨轉(zhuǎn)換活躍，血清中PINP和β-CTx的含量升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在去卵巢9周后，OVX組大鼠股骨密度顯著低于SHAM組，血清PINP及β-CTx水平顯著高于SHAM組(P<0.05)，此結(jié)果與董培智、蔣宜偉等[17,18]的研究結(jié)果相同，說(shuō)明本研究選用10周齡大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型建立成功。

圖2 CP對(duì)去卵巢大鼠股骨礦物質(zhì)(Ca、Mg、Zn、Mn)含量的影響Fig.2 Effect of CP on the contents of femur minerals (Ca, Mg, Zn, Mn) in ovariectomized rats

圖3 CP對(duì)去卵巢大鼠股骨羥脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of CP on the content of hydroxyproline in femur of ovariectomized rats

骨密度是分析骨代謝變化的重要內(nèi)容，通過(guò)測(cè)量骨密度可了解骨吸收與骨形成的狀態(tài)，評(píng)價(jià)骨骼的脆性[15]。本研究通過(guò)對(duì)各組的大鼠股骨密度的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CP各劑量組大鼠股骨密度均顯著高于OVX組，其中CP-M組大鼠股骨密度在藥物劑量組中最高，但達(dá)不到SHAM組水平(P<0.05)，此結(jié)果與韓龍等[19]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明CP可以在一定程度上提高去卵巢大鼠的股骨密度，但無(wú)法恢復(fù)到正常狀態(tài)。

圖4 大鼠PINP(左)及β-CTx(右)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curves of PINP and β-CTx

表1各組大鼠血清中PINP和β-CTx的含量(n=8)

Table1 Concentrations of PINP and β-CTx in rat serums

分組GroupsPINP/pg·mL-1β-CTx/pg·mL-1SHAM組2 258.55±140.87d370.98±61.89cOVX組3 528.37±154.74a529.67±23.63aE22 877.19±233.87bc416.042±42.56bcCP-H3 313.34±189.46b488.80±33.92abCP-M2 694.52±311.45c483.79±78.06abCP-L2 536.42±231.07cd398.36±79.43bc

骨的礦物質(zhì)成分提供了骨的硬度和剛度，而骨有機(jī)質(zhì)中的主要成分—骨膠原能夠保持骨骼的韌性[20]。骨的礦物質(zhì)中Ca、Mg、Mn和Zn的含量對(duì)骨量影響較大，Ca是骨組織的主要元素，Ca的流失會(huì)導(dǎo)致OP；Mn攝入不足會(huì)抑制成骨細(xì)胞活性，進(jìn)而引起OP；Mg是骨生長(zhǎng)中的必需元素；缺Zn則會(huì)導(dǎo)致骨代謝紊亂，骨形態(tài)結(jié)構(gòu)異常[21]。羥脯氨酸是骨膠原組織的主要成分之一，其含量能直接反應(yīng)骨代謝情況，當(dāng)其含量降低時(shí)，往往預(yù)示著OP的發(fā)生[22]。

本研究中，OVX組大鼠股骨中骨礦物質(zhì)(Ca、Mg、Mn、Zn)含量及羥脯氨酸含量均顯著低于SHAM組，而CP各組去卵巢大鼠股骨中骨礦物質(zhì)(Ca、Mg、Mn、Zn)含量及羥脯氨酸含量均顯著高于OVX組(P<0.05)，與那曉琳等[23]研究結(jié)果相同，說(shuō)明CP能有效抑制去卵巢大鼠骨礦物質(zhì)與骨有機(jī)質(zhì)的流失。

血清中PINP和β-CTx是國(guó)際骨質(zhì)疏松基金會(huì)(International Osteoporosis Foundation，IOF)推薦的骨代謝標(biāo)志指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果顯示CP各劑量組的大鼠血清PINP及β-CTx水平顯著低于OVX組(P<0.05)，與蔣宜偉[18]等的研究結(jié)果相同，表明CP可以降低血清中骨代謝標(biāo)志物的水平，進(jìn)而降低骨轉(zhuǎn)換效率，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，羊骨膠原肽可以通過(guò)提高去卵巢大鼠的骨密度，抑制骨礦物質(zhì)與骨有機(jī)質(zhì)的流失，降低血清中骨代謝標(biāo)志物水平，從而改善去卵巢大鼠的疏松骨質(zhì)。