錦燈籠提取物對6種植物病原真菌的抑制作用研究

楊春，李婷，蔣凌蕓，郅曉燕，王熠，曹揮

(山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

在現(xiàn)階段的植物病害防治過程中，盡管化學合成農(nóng)藥仍發(fā)揮著重要的作用，但其在長期使用過程中暴露出來的農(nóng)藥殘留、抗藥性加劇、環(huán)境污染等問題已日趨嚴重[1]。因此，尋找和開發(fā)安全高效、低殘留、環(huán)境友好的新型植物病害防護劑已顯得十分迫切。其中，自然界植物在長期進化和生命過程中會產(chǎn)生諸多抵御病蟲害入侵的手段，而大多數(shù)的防御作用是通過其生命過程中產(chǎn)生的多種活性代謝物質來實現(xiàn)的[2，3]。以這些活性次生代謝物為基礎開發(fā)新型植物源農(nóng)藥相比于傳統(tǒng)合成農(nóng)藥具有諸多的優(yōu)點[4，5]，如：(a)選擇性強，作用靶標專一，對非靶標生物安全；(b)次生代謝物源自植物的生命過程中，環(huán)境兼容性好，在自然界中更易被降解；(c)基于植物長期進化的復雜性和多樣性，活性代謝物種類繁多，作用方式特異，有害生物不易產(chǎn)生抗藥性等。因此，以自然界中具有藥理作用的植物為研究材料，發(fā)掘具有農(nóng)用生物活性的天然物質，開發(fā)安全性高、殘留量低以及環(huán)境相容的植物源農(nóng)藥，是當前新型植物病蟲害防護劑的一個發(fā)展趨勢[6～8]。

錦燈籠，又名紅姑娘、紅燈籠、燈籠果、掛金燈等，為茄科植物酸漿(PhysalisalkekengiL. var.franchetii(Mast.)Makino)的干燥宿萼或帶果實的宿萼，廣泛分布于中國、俄羅斯、日本以及朝鮮半島等歐亞大陸[9]。其干燥的宿萼或帶果實的宿萼具有清熱解毒、利尿、利痰等作用[10]。此外，現(xiàn)代研究表明其體內(nèi)含有豐富的甾體、黃酮、生物堿以及單萜類等多種次級代謝產(chǎn)物[11，12]，這些次級代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出優(yōu)良的抗菌[13～16]、抗氧化[17]、抗癌[18]、消炎[19]、鎮(zhèn)痛和利尿[20，21]等藥用活性。但現(xiàn)階段關于其對植物病原真菌的抑制作用還未見報道，因此，本文以錦燈籠干燥帶果實的宿萼為研究材料，測試其粗提物對供試植物病原真菌的抑制效果，旨在篩選出高活性的抑菌物質。本研究具有較強的新穎性和潛在的應用價值，可為進一步開發(fā)新型綠色植物源抗菌劑提供試驗和理論依據(jù)，同時也符合當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中“減肥減藥”的綠色發(fā)展理念。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

藥品及試劑：葡萄糖，瓊脂粉，丙酮，乙酸乙酯，石油醚(沸程60～90 ℃)，無水乙醇，吐溫-80，98%多菌靈原藥等(均為市售分析純)。

供試材料：錦燈籠(干燥帶果實的宿萼)，購于河北安國藥材市場。

供試植物病原真菌：蘋果樹腐爛病菌(ValsamaliMiyabe et Yamada.)、梨黑斑病菌(AlternariakikuchianaTanaka)、茄子枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp. melonganae)、蘋果樹干輪紋病菌(Botryosphaeriaberengerianaf. sp. piricola)、番茄早疫病菌(Alternariasolani(Ell. et Mart)Jones et Grout)和葡萄圓斑根腐病菌(Fusariumspp.)。以上病原菌均保藏于山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理學實驗室，活化后即可使用。

供試植物：未成熟的番茄果實(為“寶石十二”感病品系，采摘于山西省太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學大學生創(chuàng)業(yè)園)。

主要儀器：FDV型氣引式粉碎機(臺灣佑崎有限公司)；IKA RV 10 digital V 型旋轉蒸發(fā)儀(艾卡廣州儀器設備有限公司)；SHB-B95型循環(huán)水式多用途真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；GR-240型熱空氣消毒箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；SPX-150型生化培養(yǎng)箱(上海皓莊儀器有限公司)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的預處理

將購得的錦燈籠藥材在室溫條件下陰干，粉碎機粉碎，過60目篩，將藥材粉末密封后置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 錦燈籠四種溶劑粗提物的提取[22，23]

稱取4份上步制備的藥材，每份500 g，裝入相應編號的浸提缸內(nèi)，分別加入藥粉3倍體積量的石油醚、乙酸乙酯、丙酮和蒸餾水，攪拌使藥粉和溶劑充分接觸。將提取缸置于超聲波提取儀中30 ℃條件下超聲波輔助提取1 h，待恢復至室溫后取出，室溫條件下浸提3 d。分別抽濾，濾渣再次裝入提取缸中，加入相應的溶劑，再重復上述操作兩次，合并相應溶劑的濾液，經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮后分別得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、丙酮提取物和水提物。稱重并采用公式1計算提取率，密封后置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)

1.2.3 錦燈籠4種溶劑粗提物的初步抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法[24，25]初步測試2 g·L-1的不同提取物對6種供試病原菌的抑菌活性，待空白對照組菌落直徑達到培養(yǎng)皿直徑的2/3以上時，采用十字交叉法測量菌落直徑(mm)，同時采用公式2計算抑菌率。

抑菌率/%=

(2)

1.2.4 錦燈籠乙酸乙酯提取物對供試病原菌的毒力測定

分別設置濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、9.0 g·L-1五個梯度，制成相應的帶毒培養(yǎng)基。其余操作同1.2.3，最終分別求出錦燈籠乙酸乙酯提取物對6種供試病原菌的毒力方程和EC50值等。

1.2.5 錦燈籠乙酸乙酯提取物對活體番茄早疫病菌的防效研究[26～28]

1)藥液的配制：稱取一定量的錦燈籠乙酸乙酯提取物，加入少量的丙酮溶解，再用事先配制的0.1%吐溫-80水溶液稀釋至10 g·L-1，低溫保存?zhèn)溆谩ｊ栃詫φ账巹┒嗑`可濕性粉劑直接用無菌水稀釋至0.1 g·L-1備用；2)供試植物材料番茄果實的消毒：將新采摘未成熟的番茄果實洗凈，然后依次用無菌水沖洗、70%酒精擦拭表面，最后用無菌水反復沖洗3次，自然晾干，置于無菌操作臺中滅菌備用；3)預防組接菌及施藥：將配制的錦燈籠乙酸乙酯提取物藥液和陽性對照藥劑藥液均勻噴灑于番茄果實表面(每個果實噴灑3～5 mL，藥液均勻覆蓋即可)，自然晾干，用砂紙在果實表面等距離創(chuàng)造兩個4 mm大小的傷口，將活化好的番茄早疫病菌菌餅接種于傷口處，放入鋪有脫脂棉的培養(yǎng)皿中，加入一定量的無菌水后保鮮膜密封(每皿一個番茄，每個藥劑重復5次)，之后置于溫度(25 ± 1) ℃、濕度60%～80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d；4)治療組接菌及施藥：將未用藥劑處理的果實按上步方法接菌，3 d后待菌斑直徑達到一定大小時，將配制好的待測藥液和陽性對照藥劑均勻噴灑于發(fā)病的番茄果實表面，其余操作同上，培養(yǎng)3 d后檢查結果；5)結果檢查及統(tǒng)計分析：待病菌在番茄果實上生長約6 d后，采用十字交叉法測量各自的病斑直徑，分別按公式3計算藥劑對番茄早疫病菌的防治效果和治療效果。

防治效果或治療效果/%=

(3)

1.3 統(tǒng)計分析

抑菌活性數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics 17.0軟件統(tǒng)計分析，其中各提取物對供試病原菌的抑菌活性差異顯著性分析采用鄧肯氏新復極差法(Duncan’s multiple range test)在P<0.05水平下得到。

2 結果與分析

2.1 錦燈籠不同溶劑的提取率

本研究分別選取了4種不同極性的溶劑來提取錦燈籠中的活性成分。從表1可以看出，極性溶劑(乙酸乙酯、丙酮和水)相比于非極性的石油醚，提取率要高出許多，而極性相似的乙酸乙酯和丙酮其提取率也基本相同。說明極性溶劑更有助于錦燈籠粗體物的提取，但是極性溶劑是否有助于抑菌活性物質的提取還有待于后續(xù)的進一步研究。

表1 4種不同溶劑對錦燈籠的提取率

Table1 The extraction yields ofPhysalisalkekengiby four different solvents

溶劑Solvent提取物性狀Extract properties提取率/%Extraction yield石油醚淡紅色膏狀物1.80乙酸乙酯紅色稠膏狀物5.18丙酮紅色稠膏狀物5.20水紅色膏狀物6.34

2.2 2 g·L-1的錦燈籠4種溶劑提取物對6種供試病原菌的離體抑菌活性

本試驗首先用2 g·L-1的4種溶劑錦燈籠提取物初篩對6種供試植物病原菌的室內(nèi)抑菌活性。從表2中的數(shù)據(jù)以及通過對活性數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗可以發(fā)現(xiàn)：其乙酸乙酯提取物對6種供試植物病原菌均有一定的抑制效果，尤其對蘋果樹腐爛病菌和番茄早疫病菌的抑制效果最為明顯，分別達到了73.53%和83.41%。通過差異顯著性檢驗也可以發(fā)現(xiàn)，錦燈籠乙酸乙酯提取物對供試病原菌的抑菌率與其它溶劑提取物的抑菌率均存在顯著的差異，其抑菌效果最為突出。錦燈籠丙酮和水的粗提物對供試菌抑制活性一般，最高者僅為51.03%；石油醚提取物對6種供試病原菌的抑菌作用均比較微弱。此試驗說明，錦燈籠乙酸乙酯提取物具有較好的抑菌活性，因此，選取錦燈籠乙酸乙酯提取物進一步求出其對6種供試病原菌的毒力回歸方程，以及抑制中濃(EC50)等。

表2 2 g·L-1的錦燈籠不同溶劑提取物對6種供試病原菌的的抑制作用/%

Table2 Inhibitory effects of different solvent extracts fromPhysalisalkekengiagainst six tested phytopathogenic fungi with a concentration of 2 g·L-1

供試提取物Test extracts96 h抑菌率Inhibition rate at 96 h蘋果樹腐爛病菌Valsa mali梨黑斑病菌Alternaria kikuchiana茄子枯萎病菌Fusarium oxysporum蘋果樹干輪紋病菌Botryosphaeria berengeriana番茄早疫病菌Alternaria solani葡萄圓斑根腐病菌Fusarium spp石油醚提取物6.76±0.15d25.93±0.14b18.40±0.01c10.50±0.09b23.28±0.03c27.08±0.01c乙酸乙酯提取物73.53±0.04a38.75±0.01ab63.31±0.01a40.35±0.67a83.41±0.10a55.42±0.02a丙酮提取物51.03±0.22b44.12±0.01a44.69±0.04b10.68±0.67b37.45±0.04b35.01±0.03b水提物25.83±0.02c31.25±0.01ab4.76±0.06d5.81±0.12c34.69±0.39b30.76±0.03b

注: 表中數(shù)據(jù)后的同列字母不同表示經(jīng)鄧肯氏新復極差法檢驗二者之間差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters indicated significant difference by Duncan′s multiple range test in same column (P<0.05).

2.3 錦燈籠乙酸乙酯提取物對供6種試病原菌的毒力

通過濃度梯度法求取錦燈籠乙酸乙酯提取物對各供試病原菌的毒力回歸方程。從表3可以看出，錦燈籠乙酸乙酯提取物對6種供試病原菌均有一定的抑制作用。其中，對番茄早疫病菌的抑制作用最為突出，EC50達到了0.79 g·L-1；其次，該提取物對蘋果樹腐爛病菌和葡萄圓斑根腐病菌也有較強的抑菌作用，EC50分別為1.30 g·L-1和1.44 g·L-1；對茄子枯萎病菌、梨黑斑病菌和蘋果樹干輪紋病菌的抑制作用相對較差，EC50分別2.58、3.75、4.40 g·L-1?？傊?，此試驗結果表明錦燈籠乙酸乙酯提取物對6種供試病原菌均有一定的抑制活性，尤其對番茄早疫病菌具有較強的離體抑菌活性。盡管與傳統(tǒng)的化學合成抑菌劑相比，該抑菌活性可能不是特別突出，但是作為新型的植物源提取抗菌劑來說活性已經(jīng)比較優(yōu)異。因此，有必要深入研究其對活體植株或器官上寄生的番茄早疫病菌的抑制效果，以驗證該提取物抗菌活性的適應性，進一步發(fā)掘其潛在的應用價值。

2.4 錦燈籠乙酸乙酯提取物對活體上番茄早疫病菌的抑制效果

10 g·L-1的錦燈籠乙酸乙酯提取物對番茄早疫病菌具有良好的預防效果和治療效果，能有效阻止病斑的生長擴大(圖1)。對于先施藥后接菌的預防組而言，在病斑生長的第4 d開始測量統(tǒng)計數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其預防效果均達到50%以上，同陽性對照藥劑多菌靈相比，其預防效果也比較明顯，說明10 g·L-1的錦燈籠乙酸乙酯提取物對番茄果實上的早疫病菌具有較好的預防作用；對于治療組而言，10 g·L-1的錦燈籠乙酸乙酯提取物同樣對發(fā)病果實具有較高的治療效果，在第5 d時甚至達到了70.1%，與陽性對照藥劑相當(表4)。

3 討論與結論

本研究首先選擇了4種常見的溶劑來浸泡提取錦燈籠中的活性成分，發(fā)現(xiàn)3種極性溶劑(乙酸乙酯、丙酮和水)的提取率較高。同傳統(tǒng)的回流提取法[20]相比，浸提法可以減少提取時對有效成分的破壞，是一種研究藥用植物活性組分時比較適用的方法。

表3 錦燈籠乙酸乙酯提取物對6種供試病原菌的的毒力Table 3 The toxicity of ethyl acetate extract from Physalis alkekengi against six tested phytopathogenic fungi

圖1 第6天時10 g·L-1錦燈籠乙酸乙酯提取物番茄早疫病菌的預防(左圖)和治療(右圖)效果(CK：空白對照；Treat：10 g·L-1錦燈籠乙酸乙酯提取物處理；CB：0.1 g·L-1多菌靈處理)Fig.1 Protective(left)and Therapeutic(right)effects of ethyl acetate extract from Physalis alkekengi against Alternaria solani with a concentration of 10 g·L-1 at 6th day in vivo(CK：blank control group；Treat：The ethyl acetate extract from Physalis alkekengi with a concentration of 10 g·L-1；CB：carbendazim)

Table4 The control efficiency of ethyl acetate extract fromPhysalisalkekengiagainstAlternariasolaniwith a concentration of 10 g·L-1

時間Time預防效果Protective effects治療效果Therapeutic effects10 g·L-1 錦燈籠乙酸乙酯提取物10 g·L-1 ethyl acetate extract0.1 g·L-1 多菌靈0.1 g·L-1 carbendazim10 g·L-1 錦燈籠乙酸乙酯提取物10 g·L-1 ethyl acetate extract0.1 g·L-1 多菌靈0.1 g·L-1 carbendazim第4天55.88 ± 0.3252.94 ± 0.2968.63 ± 0.4960.26 ± 0.22第5天55.67 ± 0.2954.64 ± 0.2870.10 ± 0.4666.67 ± 0.46第6天51.58 ± 0.2458.95 ± 0.3165.26 ± 0.3867.01 ± 0.42

為了明確哪種溶劑提取物能最大程度的提取活性成分，進而測試了其在2 g·L-1濃度對6種供試植物病原菌的室內(nèi)抑菌效果，結果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物的抑菌效果最為突出，2 g·L-1濃度下對所有供試菌的抑菌率均超過了40%，其中對蘋果樹腐爛病菌和番茄早疫病菌的抑制作用最為明顯，高達73.53%和83.41%。因此，初步選定乙酸乙酯可以作為提取錦燈籠抑菌活性物質的理想溶劑。前人研究錦燈籠的抗細菌活性，多采用了水或者乙醇為提取溶劑[13, 14]，而本文研究發(fā)現(xiàn)采用乙酸乙酯可以最大程度的提取其抗真菌活性組分，而其水提物的活性卻比較差?？赡艿脑蚴欠謩e采用水和乙酸乙酯提取，得到的提取物成分差異比較大，張楠等[11]報道乙酸乙酯提取物主要包含多種酸漿苦素類物質，而水提物可能主要為多種色素和糖類，這與本文得到的結果是一致的。

同時進一步采用濃度梯度法測定錦燈籠乙酸乙酯提取物對6種供試病原菌的室內(nèi)離體毒力，發(fā)現(xiàn)其對番茄早疫病菌的毒力最強，EC50達到了0.79 g·L-1；對蘋果樹腐爛病菌和葡萄圓斑根腐病菌也有較強的抑菌作用，EC50分別為1.30 g·L-1和1.44 g·L-1，而對其余3種供試菌則表現(xiàn)出相對較弱的抑制作用。此部分結果說明錦燈籠乙酸乙酯提取物具有較強且廣泛的抗植物病原真菌活性，也填補了錦燈籠抗真菌作用研究領域的空白。

為了驗證錦燈籠提取物對活體上寄生的植物病原菌是否具有同樣的抑制能力，試驗選取離體抑菌活性最好的番茄早疫病菌為供試病原菌，測試了10 g·L-1錦燈籠乙酸乙酯提取物對番茄果實上寄生的早疫病菌的防治效果。結果發(fā)現(xiàn)該提取物對番茄早疫病菌同時具有較好的預防效果和治療效果，第4～6天的預防效果和治療效果分別達到了50%和65%以上，與商品化對照藥劑多菌靈相比，其活體防治效果也比較優(yōu)異。通過本階段的研究，證實了錦燈籠乙酸乙酯提取物優(yōu)良的離體和活體抗植物病原真菌能力，也進一步挖掘了其應用潛力。

綜上所述，盡管已有文獻報道了錦燈籠的抗細菌活性，而本文的研究更進一步證實了錦燈籠宿萼中擁有明顯的抗植物病原真菌活性物質，豐富了錦燈籠的生物活性譜。這些抑菌活性物質對離體培養(yǎng)和活體寄生的植物病原菌都具有較強的抑制作用，具備進一步開發(fā)成植物源抗菌劑的潛力。本試驗結果雖然說明錦燈籠宿萼提取物對植物病原真菌也具有良好抑制作用，進一步證實了錦燈籠體內(nèi)存在抑菌活性物質，但是只測定了錦燈籠粗提物的抑菌活性，對其具體抑菌成分以及初步的抑菌作用機理等均沒有涉及，還有待于進一步深入研究探討。