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    陸地棉GhNHX7基因特征及表達的生物信息學分析

    2019-03-02 03:43:10周麗容譚新
    中國棉花 2019年2期
    關(guān)鍵詞:耐鹽結(jié)構(gòu)域元件

    周麗容,譚新

    (新疆阿拉爾市十六團農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站,新疆阿拉爾843018)

    棉花是世界上主要的天然纖維作物。中國是世界棉花的主產(chǎn)區(qū),新疆是中國最大的棉花種植區(qū)[1]。盡管棉花是鹽堿地的先鋒作物,新疆土壤次生鹽堿化仍然嚴重制約棉花生產(chǎn),影響中國棉花生產(chǎn)安全。盡管科學家投入了大量的工作研究棉花耐鹽機理、選育耐鹽棉花品種,但對于棉花鹽脅迫的調(diào)控機理尚不清晰。前人研究發(fā)現(xiàn),擬南芥中位于質(zhì)膜上的鈉氫交換蛋白NHX7/SOS1(Sodium/hydrogen exchanger 7//salt overly sensitive 1)參與Na+/H+轉(zhuǎn)運,維持胞內(nèi)Na+和K+穩(wěn)態(tài),是響應鹽脅迫響應的必需基因[2]。SOS1蛋白通過與一系列蛋白SOS2、SOS3等組成SOS(Salt-overly-sensitive SOS)信號途徑來維持離子穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)鹽脅迫響應[2-5]。擬南芥AtNHX7/SOS1基因結(jié)構(gòu)復雜,含有23個外顯子和22個內(nèi)含子,編碼區(qū)序列長度為3 438 bp,編碼包含1 146個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。該蛋白分子量為127 kD,其N端高度疏水,C端高度親水,包含12個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域[6]。目前,尚未在陸地棉中鑒定并分析GhNHX7基因。棉花基因組序列的測定與發(fā)表[7-10]為我們挖掘鹽脅迫響應基因、分析相關(guān)基因功能提供了資源。我們通過在陸地棉基因組中掃描獲得了2個GhNHX7基因。通過基因、蛋白及啟動子序列分析,了解該基因的特征。對鹽脅迫下GhNHX7基因的表達進行分析,表明該基因參與鹽脅迫的響應。本研究為進一步探討GhNHX7基因在棉花鹽脅迫響應中的功能奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 GhNHX7基因鑒定及啟動子序列獲取和基因結(jié)構(gòu)分析

    在UNIPROT(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中檢索并下載擬南芥AtNHX7/SOS1基因。用AtNHX7/SOS1(ID:Q9LKW9)序列作為探針,通過同源性搜索BLASTP軟件檢索陸地棉基因組(Gossypium hirsutumGenome NAU-NBI Assembly v1.1 &Annotation v1.1,https://www.cottongen.org/node/2068581)蛋白注釋文件[11]。在棉花基因組中提取GhNHX7基因起始密碼子ATG上游2 000 bp(base pair,堿基對)序列作為該基因的啟動子。根據(jù)基因序列和CDS序列,利用Gene Structure Display Server(GSDS)2.0[12](http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)軟件展示GhNHX7基因結(jié)構(gòu)。利用MCScanX[13]軟件分析GhNHX7基因的復制類型。

    1.2 GhNHX7蛋白結(jié)構(gòu)域、保守基序分析

    用Pfam數(shù)據(jù)庫和NCBI CD search tool檢索GhNHX7蛋白保守結(jié)構(gòu)域;用MEME(http://memesuite.org/)數(shù)據(jù)庫檢索GhNHX7蛋白中的基序,識別數(shù)設置為10。

    1.3 GhNHX7基因啟動子中順式作用元件分析

    利用植物啟動子序列順式作用元件識別數(shù)據(jù)庫PLACE[14](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)檢 索AtNHX7/SOS1,GhNHX7a和GhNHX7b的啟動子序列中的順式作用元件。

    1.4 GhNHX7基因表達分析

    GhNHX7基因表達數(shù)據(jù)來自于NCBI數(shù)據(jù)庫中Gossypium hirsutumTM-1的RNA測序數(shù)據(jù)數(shù)據(jù),登陸號為PRJNA248163(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA248163)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GhNHX7基因鑒定

    通過同源性檢索,在陸地棉基因組中鑒定出與擬南芥AtNHX7/SOS1相似性最高的2個基因Gh_A03G0996(相似度63%),Gh_D02G1385(相似度63%),分別命名為GhNHX7a和GhNHX7b(表1)。GhNHX7a和GhNHX7b分別位于A03和D02的染色體的中部區(qū)域。通過MCScanX分析發(fā)現(xiàn),GhNHX7a和GhNHX7b基因隨著全基因組/片段復制事件的發(fā)生而擴增。GhNHX7a和GhNHX7b分別包含22個和21個外顯子,與AtNHX7/SOS1外顯子數(shù)目相近。GhNHX7a和GhNHX7b基因的編碼區(qū)序列長度分別為3 549 bp和3 555 bp,GC含量均為41%。GhNHX7a和GhNHX7b分別編碼包含1 182和1 184個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),分子量分別為131.437 kD和132.242 kD。

    表1 GhNHX7基因鑒定及特征

    2.2 GhNHX7基因結(jié)構(gòu)特征

    利用GSDS 2.0軟件可視化AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b基因結(jié)構(gòu)(圖1)。GhNHX7a和GhNHX7b分別包含有22和21外顯子,21個和20個內(nèi)含子。GhNHX7a和GhNHX7b與AtNHX7的外顯子特征較為相似,但內(nèi)含子長度差異較大,可見其基因的長度差異是內(nèi)含子區(qū)序列擴張引起的。

    2.3 GhNHX7蛋白結(jié)構(gòu)特征

    如圖2所示,通過在Pfam數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)GhNHX7a/b基因都具有鈉氫交換區(qū)(Na_H_exchanger)結(jié)構(gòu)域(PF00999)。這個結(jié)構(gòu)域在N端具有10~12個跨膜結(jié)構(gòu),在C端具有1個大的胞質(zhì)區(qū)(親水區(qū))。第3~12跨膜區(qū)相比其他Na_H_Exchanger家族成員較為一致。其中第6和第7跨膜區(qū)高度保守,被認為是轉(zhuǎn)運Na+和H+的區(qū)域。在NCBI CD-search Tool中檢索發(fā)現(xiàn)GhNHX7a、GhNHX7b和AtNHX7/SOS1基因除了具有PF00999結(jié)構(gòu)域外,還具有環(huán)化核苷酸結(jié)合區(qū)(Cyclic nucleotide-binding,cNMP-binding)結(jié)構(gòu)域(PF00027)。

    圖1 AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b基因結(jié)構(gòu)

    圖2 AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b蛋白特征

    2.4 GhNHX7基因啟動子區(qū)順式作用調(diào)控元件分析

    利用植物啟動子序列順式作用元件識別數(shù)據(jù)庫PLACE檢 索AtNHX7/SOS1,GhNHX7a和GhNHX7b的啟動子序列的順式作用元件。如表2所示,AtNHX7/SOS1,GhNHX7a和GhNHX7b的啟動子序列具有較多相同的高度富集順式作用元件,其中MYC、ARR1-binding element和Dof是重要的脅迫響應元件。推測GhNHX7a和GhNHX7b參與了陸地棉脅迫響應進程。

    表2 GhNHX7基因啟動子區(qū)順式作用調(diào)控元件類型及數(shù)目

    2.5 GhNHX7a/b基因在鹽脅迫后和不同組織的表達分析

    為了解GhNHX7a/b在棉花生長發(fā)育和響應鹽脅迫中的潛在功能,我們研究了GhNHX7a/b鹽脅迫的葉片中和在生長發(fā)育過程不同棉花組織中的表達量。與0 h相比,鹽脅迫后1 h、3 hGhNHXT7a在棉花葉片中表達量無變化;在鹽脅迫處理后6 h和12 h表達量提高(圖3A),即GhNHX7在處理中期(處理后6~12 h)參與了鹽脅迫響應調(diào)控。由圖3B可以看出,GhNHX7a/b基因在萼片、葉、花、雌蕊、根、雄蕊、莖和花托中的均表達;GhNHX7a基因在莖中的表達量最高,GhNHX7b基因在各個組織中的表達差異不大。

    3 討論與結(jié)論

    隨著我國棉產(chǎn)區(qū)西進東移戰(zhàn)略的進行,新疆成為我國棉花主產(chǎn)區(qū),但新疆地區(qū)土壤鹽漬化嚴重[15]。因此,通過基因工程提高棉花鹽脅迫抗性、選育耐鹽品種對保障棉花生產(chǎn)安全非常重要。因棉花基因組的復雜性,研究陸地棉鹽脅迫響應機理,挖掘耐鹽基因較為困難。采用同源性檢索等生物信息分析的方法,在棉花基因組中查找其他物種中已經(jīng)明確的鹽脅迫響應基因,是1種較為快速的探索棉花耐鹽機理的方法。

    圖3 GhNHX7a和GhNHX7b基因在鹽脅迫下及不同組織中的表達

    擬南芥的SOS(salt-overly-sensitive)信號網(wǎng)絡,是第一個發(fā)現(xiàn)的非生物脅迫響應網(wǎng)絡[16]。在前人不斷的研究探索下[2-5,17-19],SOS信號網(wǎng)絡被證實并完善。這個信號網(wǎng)絡主要包括3個重要的組分:SOS1,SOS2,SOS3。其中SOS1是定位于質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白,能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的Na+含量,受到SOS2和SOS3基因的調(diào)控。擬南芥的AtNHX7基因在根、莖和葉中均表達,且在根中表達水平比莖中高[20]。在本研究中,通過同源性檢索的方法,在陸地棉基因組中檢索到了2個GhNHX7基因,分別命名為GhNHX7a和GhNHX7b。這2個基因具有與SOS1基因相似的結(jié)構(gòu),分別具有22和21個外顯子。同時發(fā)現(xiàn)GhNHX7a/b蛋白具有與SOS1同樣的Na_H_Exchanger和cNMP_binding結(jié)構(gòu)域。保守基序分析發(fā)現(xiàn),SOS1和GhNHX7a/b的保守基序一致。GhNHX7a/b的生物信息分析表明其可能具有與SOS1基因相同的功能。啟動子區(qū)順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),SOS1和GhNHX7a/b具有大量相同的順式作用元件,例如MYC、ARR1-binding element和Dof是重要的脅迫響應元件。推測在陸地棉中,GhNHX7a/b基因是脅迫響應基因?;虮磉_分析發(fā)現(xiàn)GhNHX7a/b基因在鹽脅迫后表達水平升高,可見其可能參與了棉花鹽脅迫響應。該研究為棉花耐鹽基因GhNHX7a/b挖掘與利用提供了依據(jù),為深入研究陸地棉耐鹽機理,利用基因工程技術(shù)進行耐鹽棉花的選育提供了資源。

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