基于噬菌體展示技術(shù)的內(nèi)毒素檢測(cè)方法

王鑫，徐美玲，張起瑩，嵇冶，張昊

（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種成分，當(dāng)細(xì)菌死亡后會(huì)大量釋放。人體內(nèi)毒素含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)熱、心跳過(guò)速、低血壓、休克甚至死亡[1]。因此人體內(nèi)毒素檢測(cè)一直是臨床及醫(yī)療器械、藥物檢測(cè)的必檢指標(biāo)。目前常規(guī)的檢測(cè)方法主要有：凝膠法、濁度法和比色法。但原理都是基于內(nèi)毒素能與鱟試劑發(fā)生特異性反應(yīng)。鱟是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，隨著檢測(cè)市場(chǎng)需求量增加，鱟血提取過(guò)度使得資源枯竭，造成鱟試劑檢測(cè)成本增高，進(jìn)而造成生態(tài)環(huán)境平衡的不可逆破壞，并且利用鱟試劑的檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，因此研究能夠替代天然鱟試劑的檢測(cè)方法迫在眉睫[2-5]。

噬菌體展示技術(shù)就是在噬菌體表面展示出具有獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)以及生物活性的肽或者蛋白，用于篩選出與特異分子結(jié)合的肽或者蛋白質(zhì)[6]。此方法目前已廣泛用于新興疫苗的研究、酶抑制劑的篩選、醫(yī)學(xué)診斷和治療藥物的開發(fā)、蛋白質(zhì)相互作用等[7-10]。

本文利用噬菌體展示技術(shù)篩選出能夠與內(nèi)毒素高效特異結(jié)合的十二肽，采用生物分子相互作用系統(tǒng)對(duì)其特異親和性進(jìn)行表征[11-12]；進(jìn)而共價(jià)偶聯(lián)乳膠微球，建立一種特異結(jié)合多肽檢測(cè)內(nèi)毒素的快速比濁定量檢測(cè)方法，當(dāng)樣品中含有被測(cè)內(nèi)毒素時(shí)，多肽能夠與內(nèi)毒素特異性結(jié)合，經(jīng)紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定600nm處微球-多肽與內(nèi)毒素復(fù)合物的吸光度值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠計(jì)算獲得被測(cè)內(nèi)毒素的含量，對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，為內(nèi)毒素檢測(cè)提供新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

M13噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)試劑盒（New England Biolabs），內(nèi)毒素（0111：B4購(gòu)自Sigma公司），內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院），鼠內(nèi)毒素單克隆抗體（Abnova），PEG8000（Amresco），SA探針試劑盒（PALL），直徑60mm培養(yǎng)皿（賽默飛），熒光酶標(biāo)板（Greiner bio one），F(xiàn)ortbio分子互作儀（PALL）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噬菌體肽庫(kù)的親和篩選

將內(nèi)毒素用包被液稀釋至10μg/mL，取1.5mL包被塑料培養(yǎng)皿，4℃過(guò)夜。次日棄去包被液，加入封閉液4℃孵育2h。棄去封閉液，TBST洗滌平皿7次。取10μL原始庫(kù)溶液用1M TBST稀釋，加入平皿，室溫輕輕搖動(dòng)1h。移去肽庫(kù)溶液，TBST洗滌平皿10次。加入1mL洗脫液，室溫平緩搖動(dòng)10min后將洗脫液收集，立即加入150μL中和液至中性。取1μL測(cè)滴度，其余加入20mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ER2738菌液中，37℃，220rpm/min孵育5h，特異性結(jié)合的噬菌體克隆得到擴(kuò)增。應(yīng)用PEG8000/NaCl沉淀噬菌體，在鋪有IPTG和X-gal的平板上測(cè)定擴(kuò)增的噬菌體的滴度。共進(jìn)行3輪親和篩選，逐步減少內(nèi)毒素濃度，縮短噬菌體克隆與內(nèi)毒素的結(jié)合時(shí)間，增加Tween20的濃度。

1.2.2 滴度測(cè)定

接種環(huán)挑取少量-70℃凍存的E.coli ER2738菌種，劃線接種于LB瓊脂板上，翻轉(zhuǎn)平皿，37℃孵育過(guò)夜。挑取ER2738菌落至5mL LB培養(yǎng)基中，在225rpm/min，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。分別加入200μL對(duì)數(shù)中期的菌液至10個(gè)EP管中。噬菌體洗脫物用LB培養(yǎng)液作梯度稀釋，每個(gè)稀釋度各取10μL分別加入裝有菌液的EP管中，快速震蕩，室溫孵育5min。分別加入3mL頂層培養(yǎng)基至4mL EP管中，置于45℃恒溫培養(yǎng)箱，將上述噬菌體與大腸桿菌混合液轉(zhuǎn)移至其中，快速震蕩，立即倒入37℃預(yù)熱的LB/IPTG/X-gal/Tet培養(yǎng)皿中，將頂層培養(yǎng)基迅速攤開。冷卻后，將培養(yǎng)皿倒置放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日觀察培養(yǎng)板，計(jì)算噬菌體滴度。1.2.3 陽(yáng)性噬菌體克隆融合肽單鏈DNA的提取和測(cè)序以及十二肽合成

取陽(yáng)性克隆噬菌體上清100μL加到宿主菌中震蕩培養(yǎng)，離心后從上清提取單鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示1條單一明亮條帶。將樣品送至上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，并合成十二肽和生物素標(biāo)記十二肽。

1.2.4 生物分子互作表征

（1）SA探針固定十二肽

用PBS溶解合成的生物素標(biāo)記十二肽至終濃度為1mg/mL做為母液，采用PBST（PBS緩沖液+0.05%Tween-20）生物素標(biāo)記十二肽母液分別稀釋 至 100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL 和 12.5μg/mL，在黑色熒光微孔板的第一列中加入200μL PBST，在第二列中分別加入稀釋的十二肽溶液200μL，37℃預(yù)熱，反應(yīng)溫度30℃；SA光纖探針在第一列PBST中激活10min，然后插入到第二列與十二肽結(jié)合5min，最后插入到第一列PBST溶液中解離5min；整理分析數(shù)據(jù)，確定SA探針固定生物素標(biāo)記十二肽的最佳濃度。

（2）生物素標(biāo)記的十二肽與內(nèi)毒素親和性

生物素標(biāo)記十二肽用PBST稀釋至最佳固定濃度，采用PBST將內(nèi)毒素分別稀釋至1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL和15.625μg/mL，在黑色熒光酶標(biāo)板第一列和第三列加入200μL PBST，第二列加入200μL生物素標(biāo)記十二肽溶液，第四列分別加入20μL梯度稀釋的內(nèi)毒素溶液并加入陰性對(duì)照PBST緩沖液；試劑37℃預(yù)熱，反應(yīng)溫度30℃，SA光纖探針首先在第一列PBST中激活10min，隨后在第二列中包被十二肽，然后在第三列PBST溶液中洗去非特異性吸附的生物素標(biāo)記十二肽，隨后在第四列包被的十二肽與內(nèi)毒素結(jié)合5min，最后在第三列中解離5min，數(shù)據(jù)分析，獲得十二肽與內(nèi)毒素結(jié)合的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)。

1.2.5 內(nèi)毒素檢測(cè)方法的建立

將合成的十二肽采用EDC/NHS共價(jià)偶聯(lián)至乳膠微球（180nm），偶聯(lián)產(chǎn)物與不同濃度內(nèi)毒素混合后孵育，由于十二肽與內(nèi)毒素能夠發(fā)生特異性結(jié)合，能夠形成復(fù)合物，使得溶液濁度隨著內(nèi)毒素濃度改變而改變，采用紫外可見光分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下檢測(cè)不同濃度內(nèi)毒素-多肽-微球復(fù)合物吸光值，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實(shí)現(xiàn)樣本中內(nèi)毒素的定量檢測(cè)。

1.2.6 方法學(xué)回收率的評(píng)估

將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別配制為0.05EU/mL、0.10EU/mL、0.20EU/mL、0.40EU/mL，采用上述建立的增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)已知濃度內(nèi)毒素，測(cè)定濃度與實(shí)際濃度的比值即為該方法的加標(biāo)回收率，用來(lái)評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的精密度與準(zhǔn)確性。

1.2.7 方法學(xué)比較

461醫(yī)院提供血清89份，利用市售鱟試劑內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒與本文建立的檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與討論

2.1 高親和性噬菌體克隆子的篩選

以內(nèi)毒素為目標(biāo)分子在十二肽庫(kù)中進(jìn)行親和篩選，經(jīng)過(guò)3輪洗脫，得到與內(nèi)毒素親和力高的噬菌體克隆子。經(jīng)3輪篩選，結(jié)果如表1所示，十二肽庫(kù)回收率從3×10-4提高至6.7×10-1。

表1 篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)回收率

2.2 陽(yáng)性噬菌體克隆融合肽單鏈DNA的提取及序列測(cè)定

碘化物法提取經(jīng)內(nèi)毒素親和性篩選獲得的8個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆單鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖1所示，將該樣本送公司測(cè)序，獲得的DNA序列經(jīng)DNASTAR軟件綜合分析，融合表達(dá)的十二肽庫(kù)氨基酸序列為QVTPQVPRSTQM。

圖1 碘化物法提取陽(yáng)性噬菌體克隆單鏈DNA的鑒定結(jié)果

2.3 生物分子互作系統(tǒng)表征十二肽與內(nèi)毒素親和性

在SA探針表面包被不同濃度生物素標(biāo)記十二肽，包被過(guò)程曲線如圖2所示，曲線4為12.5μg/mL生物素標(biāo)記十二肽，結(jié)合曲線上升速度均勻，且信號(hào)強(qiáng)度較高，因此為最適包被濃度。

包被有十二肽的SA探針在梯度稀釋內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液中進(jìn)行結(jié)合與解離檢測(cè)，測(cè)定曲線如圖3所示，解離平衡常數(shù)KD即二者親和力能夠達(dá)到3.52×10-9，該數(shù)值越小，證明篩選出的十二肽與內(nèi)毒素親和力越強(qiáng)。利用上述方法分別對(duì)50mg/L的（1，3）-β-D-葡聚糖，海藻糖，葡萄糖與十二肽的結(jié)合/解離平衡常數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，篩選出的十二肽與（1，3）-β-D-葡聚糖，海藻糖，葡萄糖無(wú)親和力。因此，篩選出的十二肽與內(nèi)毒素的結(jié)合是高度專一的。

圖2 SA探針表面包被不同濃度生物素標(biāo)記十二肽過(guò)程曲線ρ十二肽（μg/ml）：A1：100.B1：50.C1：25.D1：12.5.

圖3 十二肽與不同濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合與解離曲線ρ內(nèi)毒素EU/mL：A4：0.48.；B4：0.24；C4：0.12.；D4：0.06；E4：0.03；F4：PBS；G4：空；H4：空

2.4 增強(qiáng)免疫比濁法內(nèi)毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配制內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.48EU/mL、0.24EU/mL、0.12EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL，用注射用水作為空白對(duì)照，分別向比色皿內(nèi)加入300μL不同濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和3mL濃度為100μg/mL十二肽（PB緩沖液稀釋），混勻，37℃反應(yīng)5min。采用紫外-可見光分光光度計(jì)，在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示，內(nèi)毒素在0.03～0.48EU/mL濃度范圍內(nèi)，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值呈正線性相關(guān)，線性方程為（y=0.0465ln(x)+0.1721），相關(guān)系數(shù)R2=0.9925，檢測(cè)下限為0.03EU/mL，檢測(cè)時(shí)間短，僅需5min。

圖4 增強(qiáng)免疫比濁法內(nèi)毒素定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 方法回收率評(píng)價(jià)

如表2所示，取300μL配制的已知濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品加入到3ml濃度為100μg/mL的十二肽溶液中，混勻，37℃反應(yīng)5min，同一濃度內(nèi)毒素反復(fù)測(cè)定5次?；厥章使浇Y(jié)果表明，該檢測(cè)方法回收率為96%～110%。

表2 回收率評(píng)估結(jié)果

2.6 方法學(xué)比較

采用市售鱟試劑內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒與本文建立的檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)50例患者血清和39例健康病人血清中內(nèi)毒素含量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如表3所示，兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性結(jié)果符合率為98%（49/50），陰性結(jié)果符合率為100%（39/39）。

表3 兩種內(nèi)毒素的檢測(cè)方法對(duì)比

3 結(jié)論

本文成功利用噬菌體展示技術(shù)篩選出能夠與內(nèi)毒素結(jié)合的十二肽，并通過(guò)分子互作技術(shù)驗(yàn)證了該十二肽與內(nèi)毒素具有高度親和性，解離平衡常數(shù)KD=3.52×10-9mol/L。將十二肽與乳膠微球偶聯(lián)后建立了增強(qiáng)免疫增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)內(nèi)毒素的新方法，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品在0.03～0.48EU/mL濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸光度值呈正線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，檢測(cè)下限達(dá)到0.03EU/mL，該方法的批間和批內(nèi)的變異系數(shù)小于5%，該方法回收率為96%～110%，與市售鱟試劑內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒同時(shí)測(cè)定血清樣本，測(cè)定結(jié)果陽(yáng)性符合率為98%，陰性符合率為100%。

增強(qiáng)免疫比濁法內(nèi)毒素檢測(cè)方法采用噬菌體展示技術(shù)篩選出與內(nèi)毒素具有高結(jié)合性的十二肽，無(wú)需利用天然鱟試劑，能夠降低檢測(cè)成本，保護(hù)自然環(huán)境生態(tài)平衡；并且該方法步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，僅需5min即可完成樣本測(cè)定，符合臨床快速檢測(cè)需求，乳膠微球在免疫比濁中起到增強(qiáng)效應(yīng)，提高了檢測(cè)靈敏度，同時(shí)該方法容易實(shí)現(xiàn)高通量，彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外檢測(cè)方法的不足，預(yù)期能夠在醫(yī)療器械，食品藥品，醫(yī)療診斷等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。