廣西貴港地區(qū)豬繁殖與呼吸障礙綜合征調(diào)查分析

張書祥，何奇松，孔子榮，郭建剛，周慶安，黃勝斌，韓銀華，熊 毅*

(1．廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001)

【研究意義】豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)俗稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等以及仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道為特征的傳染病[1]。高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征(HP-PRRS)，是由PRRSV變異而引起的一種急性、高傳染性、高致病性傳染病。20世紀90年代初豬繁殖與呼吸障礙綜合征在歐洲大爆發(fā)，一共造成了超過100萬頭豬死亡[2-4]。高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征于2006年底傳入廣西，2007年底引起大爆發(fā)[5]。廣西地區(qū)近年來養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展迅速，特別是貴港地區(qū)年出欄數(shù)穩(wěn)步上升，成為當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展的重要組成板塊。開展廣西貴港地區(qū)豬繁殖與呼吸障礙綜合征調(diào)查分析可為該地區(qū)豬繁殖與呼吸障礙綜合征的疫情控制、流行狀態(tài)、防治重點提供科學(xué)參考。【前人研究進展】PRRSV是動脈炎病毒屬(Arterivirus)成員，單股正鏈RNA，長約15 kb，共有10個開放閱讀框(ORF)，編碼多個非結(jié)構(gòu)蛋白和8個結(jié)構(gòu)蛋白[6]。20世紀國內(nèi)外有關(guān)研究學(xué)者從豬病體內(nèi)分離出該病毒[7-9]，宋云義等[10]研究結(jié)果表明，舊的商品豬場種豬群藍耳病陽性率為98.18 %，仔豬群陽性率為78.65 %，而新建商品豬場種豬群藍耳病陽性率為63.64 %,仔豬群陽性率為9.52 %。2006年，豬繁殖與呼吸障礙綜合征在中國的10多個省(市，區(qū))檢測到，超過2百萬頭感染，約40頭豬死亡[11]，彭紅[12]對湖南省桑植縣的578份血樣進行了PRRSV抗原檢測，陽性率為43.51 %；楊澤林]等[13對重慶市794份組織樣品進行了HP-PRRSV檢測，陽性率為85.1 %。任奕先[14]等對廣西桂林地區(qū)PRRS流行情況進行調(diào)查，PRRS的陽性率為22.9 %；HP-PRRSV在我國流行至今可以分為3階段：2006-2008年主要是美洲型(VR-2332)，全國各地區(qū)也在同一時期分離到的毒株序列比較雜亂；2009-2010年HP-PRRSV仍然以美洲型為主，致病性與VR-2332一致，傳染性都很強；2011年以后仍以高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒為主，同時有美洲型、高致病性、歐洲型3種毒株存在[15-16]。豬扁桃體是機體重要的免疫器官,具有抗細菌、抗病毒的防御功能，也是多種病原微生物侵襲、定居、復(fù)制的重要場所，采集豬扁桃體樣品，用于監(jiān)測、診斷常見疫病，具有很強的代表性，但目前研究報道較多是采集病死豬的扁桃體或組織病料進行監(jiān)測，對規(guī)模豬場臨床健康豬大量進行活體采集扁桃體，再進行監(jiān)測分析的報道較少?！颈狙芯壳腥朦c】采集豬活體扁桃體進行檢測，能較全面及客觀的反映規(guī)模豬場養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中病毒感染、潛伏、流行情況，并可根據(jù)監(jiān)測需求，多次進行重復(fù)采樣監(jiān)測，極大提高檢測的時效性與準確性，為臨床生產(chǎn)上制定科學(xué)、合理的疾病防控方案提供可靠數(shù)據(jù)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對廣西貴港地區(qū)2017年P(guān)RRS的感染情況進行調(diào)查與分析，以期為今后PRRS的深入研究及有效防控提供科學(xué)依據(jù)，為廣西地區(qū)PRRS的臨床診斷及疫苗的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及陽性對照

樣品來自廣西貴港地區(qū)111個規(guī)模豬場的1865份扁桃體；陽性對照為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(HuN4-F112株)和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(CH-1R株)，均購自黑龍江省哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑

RNAprep pure Tissue Kit RNAprep pure核酸抽提試劑盒購自TianGen公司、One Step RT-PCR Kit Ver.2購自TaKaRa公司，6xLoading Buffer購自TaKaRa公司，DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司，Ager Powder購自Solarbio公司，Gelred購自BIOTIUM公司，用Premier5、Oligo6等分子生物學(xué)分析軟件設(shè)計引物，引物均由TaKaRa公司合成。

1.3 樣品的制備

將采集的扁桃體放入無菌的離心管管中，加入高壓過的鋼珠和1 mL的滅菌生理鹽水，用研磨儀在27.0 Hz的頻率下研磨3 min，研磨后的樣品反復(fù)凍融3次后，10 000 r/min于冷凍離心機離心5 min，取上清于-40 ℃或-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA的抽提

根據(jù)TianGen公司的RNA抽提試劑盒說明書進行RNA的抽提，同時設(shè)置高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒與經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的陽性對照，以及陰性對照。抽提RNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物的合成

參考VR-2332 ( GenBank No. AY-150564) 、CH-1a ( GenBank No. AY032626) 、JXA1( GenBank No. EF112445)設(shè)計并合成了一對引物P1/P2, 所設(shè)計引物位于緊靠缺失90個核苷酸區(qū)域兩端的保守區(qū)。高致病性PRRSV株和經(jīng)典PRRSV 株的預(yù)期擴增產(chǎn)物長度分別約426和516 bp。上游引物P1：5′-GGC GACAATGTCCCT AAC-3′; 下游引物P2：5′-GATGGCTTGAGCTGAGTAT-3′。引物由TaKaRa公司合成。

1.6 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)

RT-PCR的反應(yīng)體系以25 μl體系反應(yīng)進行：體系內(nèi)試劑成分及試劑劑量分別為：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μl、2×1 step Buffer 10 μl、RNase Free dH2O 8 μl、P1 0.5 μl、P2 0.5 μl、待檢RNA產(chǎn)物 5 μl。

反應(yīng)程序。第1步：反轉(zhuǎn)錄，42 ℃ 45 min,94 ℃ 5 min；第2步：PCR程序為94 ℃ 40 s、56 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，共進行34個循環(huán)；第3步：72 ℃延伸10 min。

1.7 RT-PCR產(chǎn)物的鑒定

在1 %的瓊脂糖凝膠上用90 V電壓電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果，拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 HP-PRRSV與classic PRRSV基因的擴增結(jié)果

應(yīng)用一步法RT-PCR檢測方法，對1875份扁桃體樣品進行PRRSV核酸檢測，若目的條帶出現(xiàn)在426 bp左右且與高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒陽性對照條帶一致，判定為高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒陽性；若目的條帶出現(xiàn)在516 bp左右且與經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒陽性對照條帶一致，則判定為經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒陽性；其余判定為陰性，其中擴增的4份陽性樣品電泳圖見圖1。

M：DL 2000 DNA marker; 1:HP-PRRSV 陽性對照; 2:經(jīng)典PRRSV 陽性對照;3:陰性對照;4:HP-PRRSV陽性樣品;5、7、8: 經(jīng)典PRRSV陽性樣品;6、9:陰性樣品圖1 HP-PRRSV與classic PRRSV基因擴增電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis results of HP-PRRSV and classic PRRSV gene amplification

2.2 規(guī)模豬場檢測結(jié)果

從表1可見，在廣西貴港地區(qū)111個規(guī)模豬場的1865份扁桃體樣品中，25個豬場檢出92份豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，其中9個豬場檢測出24份高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，樣品陽性率為1.29 %；18個豬場檢測出68份經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，樣品陽性率為3.65 %；2個豬場同時檢測出高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒。在25個陽性豬場中，感染高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒最高的豬場陽性率為45.00 %；感染經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒最高的豬場陽性率為75 %。

表1 檢測陽性豬場RT-PCR檢測結(jié)果Table 1 Results of RT-PCR test in positive pig farm

表2 不同免疫狀況PRRS核酸檢測結(jié)果Table 2 Results of PRRS nucleic acid detection in different immune conditions

表3 不同地區(qū)PRRS核酸檢測表Table 3 PRRSV nucleic acid detection table in different regions

2.3 不同免疫狀況下PRRS核酸檢測結(jié)果

對采樣豬群的免疫背景進行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，免疫、未免疫、免疫不詳豬群的PRRSV陽性率分別為7.45 %、1.15 %、4.05 %，場點陽性率分別為20.69 %、5.26 %、25.00 %(表2)。其中，免疫后的豬場樣品陽性率與場點陽性率均顯著(P<0.05，下同)，高于未免疫的豬場。

2.4 不同區(qū)域PRRSV核酸檢測結(jié)果

對不同采樣地區(qū)進行分析發(fā)現(xiàn)，貴港市周邊區(qū)域、桂平縣、平南縣的陽性份數(shù)分別是61、28、3份，陽性率分別是5.04 %、6.29 %、1.42 %(表3)?？梢姽鹌绞蠵RRSV的陽性率最高，貴港市PRRSV的陽性率次之，平南縣PRRSV的陽性率最低，說明三大區(qū)域均不同程度受到PRRSV的感染，其中以桂平及貴港周邊區(qū)域較為嚴重，應(yīng)因地制宜，做出針對性的防控對策。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，在111個豬場中有2個豬場同時檢測出高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，說明該地區(qū)豬場中存在有高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的混合感染。有關(guān)研究表明，感染豬群在受外界環(huán)境、氣候等因素的影響時，可導(dǎo)致豬群的應(yīng)激抗力或免疫力下降，使病毒毒力增強，同時在受強毒、野毒和其它病原微生物的攻擊，即可出現(xiàn)從單一病原體所致的多重感染或混合感染，因而生產(chǎn)上常見呼吸道并發(fā)病、繼發(fā)感染和混合感染的病例顯著上升[17-19]。疫苗使用不當導(dǎo)致的疫苗毒反強以及野毒感染也可直接引起混合感染情況的發(fā)生[20-22]。

另外有9個豬場檢測出24份高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，場點陽性率為8.10 %，樣品陽性率為1.29 %，18個豬場檢測出68份經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，場點陽性率為16.2 %，樣品陽性率為3.65 %，感染經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒豬場的比例比感染高致病豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的比例高出很多，說明貴港地區(qū)以經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的流行為主要趨勢。分析此結(jié)果原因有2點：①高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒對溫度較敏感，在外界環(huán)境的生存能力較弱，一般在37 ℃環(huán)境下3到24小時，或56 ℃環(huán)境下6 ～20 min病毒即可喪失活性；在4 ℃時，1周內(nèi)活性下降90 %；對pH敏感，當pH值小于6或大于7.5時，其感染性很快喪失；當pH 6.5～7.5時病毒穩(wěn)定[23]。所以貴港地區(qū)在HP-PRRS流行很少的大環(huán)境下這種趨勢在接下來可能仍會持續(xù)下去。②經(jīng)典型豬繁殖與呼吸障礙綜合征一旦感染后豬群是長期帶毒或終生帶毒，致死率較低，帶毒豬可長期作為傳染源存在，并且其生活的環(huán)境，豬舍、豬糞及污染的水源也都可以作為感染源，很容易將病毒通過這些渠道感染給其他易感豬群。貴港地區(qū)雖然仍以經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征流行為主要趨勢，但仍然要對高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征保持高度警惕。

本研究中PRRSV的樣品陽性率相對較低，僅為4.93 %。這主要與檢測的樣品類型有關(guān)，本研究的樣品均為活體采集自正常豬的扁桃體，而上述研究檢測的樣品多數(shù)為發(fā)病豬的組織樣品。發(fā)病豬在確診發(fā)病后進行檢測，不能夠?qū)崿F(xiàn)對豬繁殖與呼吸障礙綜合征疫情的動態(tài)監(jiān)測與豬場實時發(fā)病情況，不能對接下來的疫情進行合理的預(yù)測，不能對帶毒豬或處于潛伏期未發(fā)病豬的檢測，有一定的局限性。活體采集生豬扁桃體進行檢測比較合理。因PRRSV感染豬群后首先在呼吸系統(tǒng)的鼻粘膜或上呼吸道大量的蓄積復(fù)制，之后進入血液后通過血液循環(huán)擴散至全身，并在單核巨噬細胞系統(tǒng)內(nèi)增殖，扁桃體作為豬主要的免疫器官，在感染PRRSV后病毒會在扁桃體內(nèi)大量的復(fù)制，采集生豬扁桃體能夠?qū)λ袔Ф矩i進行檢測，并不局限于發(fā)病豬，所以可以根據(jù)檢測結(jié)果了解豬繁殖與呼吸障礙綜合征在豬場內(nèi)的感染情況、潛伏情況、以及對整個地區(qū)的流行情況進行分析，對接下來的疫情發(fā)展做出合理預(yù)測并及時采取措施?；铙w采集后第一時間檢測也大大提高了檢測的準確性。

通過對貴港地區(qū)的貴港市周邊地區(qū)、桂平市、平南縣的陽性情況統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，桂平市的陽性率最高，達到了6.29 %，貴港市周邊地區(qū)陽性率次之為5.04 %，這兩個地區(qū)都顯著高于平南縣1.42 %的陽性率，提示桂平市及貴港周邊地區(qū)生豬養(yǎng)殖環(huán)節(jié)應(yīng)做好嚴格的引種控制，以及人員和運輸工具出入控制，并加強生物安全管理及衛(wèi)生防疫工作。

在對2017年貴港地區(qū)豬繁殖與呼吸障礙綜合征的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)免疫豬群陽性率為7.45 %，顯著高于未免疫組群的1.15 %，分析原因可能是目前對PRRS的防控仍以免疫接種為主，在免疫過程中疫苗的選擇不夠科學(xué)，不能良好的控制疫情的發(fā)生，滅活苗與弱毒苗在使用后可能引起的反強也會導(dǎo)致豬的感染，而且免疫接種不能徹底解決PRRSV的持續(xù)感染和帶毒問題，所以注射疫苗后原有感染豬仍然可以檢測出陽性，并持續(xù)作為傳染源，這也可能是導(dǎo)致本研究中免疫豬群的PRRSV陽性率比非免疫豬群高的一個原因，另一方面可能是由于PRRS活疫苗的普遍、頻繁、不合理使用，導(dǎo)致該病越變復(fù)雜，成為豬場的“常在性”疫病。PRRSV在流行的過程中較容易發(fā)生變異，特別是HP-PRRSV的變異速度更快，對于豬繁殖與呼吸障礙綜合征疫情相對于穩(wěn)定的豬場，不推薦使用高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征弱毒苗。對PRRS的防控仍然以科學(xué)的豬場管理和適合的免疫機制為主，疫苗的選擇應(yīng)結(jié)合當?shù)丶柏i場的實際情況進行。

4 結(jié) 論

廣西貴港地區(qū)豬群中PRRSV仍以經(jīng)典株流行為主要趨勢，免疫豬群PRRSV陽性率高于未免疫豬群，桂平市及貴港周邊地區(qū)感染情況較平南縣更為嚴重。