青海高原197份小麥品種(系)及種質(zhì)資源抗條銹分子鑒定

袁飛敏，權(quán)有娟，劉德梅，陳志國(guó)*

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008)

【研究意義】小麥條銹病是由條形柄銹菌小麥?；?PucciniastriiformisWest. f. sp.triticiErikss. et Henn.,Pst)引起的小麥葉部氣傳病害，是全世界小麥生產(chǎn)上最重要的病害之一。中國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)作為小麥條銹病最大的流行區(qū)域，也是小麥條銹病發(fā)生面積最大、受危害最嚴(yán)重的國(guó)家之一[1]。小麥條銹病的防治涉及多方面的措施，包括農(nóng)業(yè)栽培管理、化學(xué)防治及抗病品種的利用等。通常培育和推廣抗病品種被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、最有效和對(duì)環(huán)境友好的一種舉措[2]。目前生產(chǎn)上利用的品種多為高抗或免疫的單基因抗性品種，由于抗源單一、小種選擇壓力增加、條銹菌高度變異性等原因，造成抗病品種在生產(chǎn)上種植3～5年后便“喪失”了抗性，引起條銹病流行，甚至大暴發(fā)，導(dǎo)致大幅減產(chǎn)，從而失去利用價(jià)值[3]。通過(guò)收集和鑒定小麥種質(zhì)資源的抗條銹性，挖掘新的全生育期抗性(all stage resistance，ASR)基因和成株期抗性(adult plant resistance，APR)基因[4]，采取多基因聚合、整合微效基因等方法，使小麥品種具有更廣譜或持久的抗條銹特性，也是目前行之有效的減輕小麥條銹病危害的重要途徑[5]。因此，明確當(dāng)前小麥主栽品種及種質(zhì)資源的抗條銹性及其所攜帶的抗條銹病基因，可為小麥抗病育種和品種合理利用提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，正式命名的小麥抗條銹病基因有78個(gè)，暫命名基因和QTLs位點(diǎn)100多個(gè)[6-7]。研究表明，ASR基因Yr5和Yr15對(duì)當(dāng)前條銹菌的流行小種均表現(xiàn)一定的抗性[8]；1BL/1RS易位系攜帶抗條銹(Yr9)、抗白粉(Pm8)、抗稈銹(Sr31)、抗葉銹(Lr26)及抗飛虱(Gb2)等多個(gè)抗病、蟲(chóng)基因及含增加小穗數(shù)等眾多優(yōu)良性狀相關(guān)的QTLs；Yr18是APR基因，被廣泛用于抗病育種，該基因與抗稈銹基因Sr34、抗葉銹基因Lr34、抗白粉基因Pm38等多個(gè)抗病相關(guān)基因連鎖，表現(xiàn)相對(duì)持久的抗條銹性[9-10]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)相繼用于抗病基因的挖掘與鑒定。迄今為止，與已知抗條銹基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26(=Yr24)等緊密連鎖的RAPD、SCAR、SSR和SNP等標(biāo)記相繼被開(kāi)發(fā)報(bào)道，這為通過(guò)分子標(biāo)記進(jìn)行快速檢測(cè)小麥品種所攜帶的抗條銹病基因提供了便利?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為明確青海高原春小麥主栽品種(系)及種質(zhì)資源抗條銹病基因分布現(xiàn)狀，選用目前小麥條銹菌流行小種CYR29、CYR32和CYR34對(duì)197份材料進(jìn)行了苗期室內(nèi)接種鑒定，以明確其抗條銹性。同時(shí)，利用已知抗條銹病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26側(cè)翼特異性分子標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)合遺傳系譜進(jìn)行抗病性綜合評(píng)價(jià)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)抗病性鑒定，解析當(dāng)前青海省春小麥主栽品種、后備品種及高代育種材料所攜帶的抗條銹病基因，篩選出含有上述抗病基因的品種資源，為青海春小麥抗病育種、抗病品種的合理布局和抗性基因資源的有效利用提供依據(jù)。本研究結(jié)果對(duì)“喪失”抗條銹小麥品種的改良，培育持久抗病新品種和對(duì)小麥條銹病持續(xù)控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試小麥品種(系)及資源材料共197份，含春性材料142份，冬性、半冬性和弱冬性材料(已馴化為春性)55份。這些材料包括青海歷年審定品種57份(含目前主栽品種，1960-2015年)，近年來(lái)參加青海省區(qū)試(水、旱地組)品種12份，參加國(guó)家西北春麥水地組區(qū)試品種26份(甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等多家育種單位提供，2004-2017年)，北方冬春麥區(qū)的新疆、山西、河北、遼寧、河南、江蘇、四川、北京等地材料 100份，本單位育種高代材料12份，品種基本覆蓋我國(guó)北方春麥區(qū)。

抗條銹病近等基因系分別是：Avocet S*6/Yr5、Avocet S*6/Yr9、Avocet S*6/Yr10、Avocet S*6/Yr15、Avocet S*6/Yr18和Avocet S*6/Yr26，由青海農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)科學(xué)研究所提供，用于分子檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照；高感條銹病對(duì)照品種銘賢169用于繁菌、感病對(duì)照和分子檢測(cè)陰性對(duì)照。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苗期接種鑒定 苗期接種鑒定在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院小麥抗病種質(zhì)資源創(chuàng)制與利用研究中心進(jìn)行，條銹菌小種由該中心提供。

苗期鑒定菌種用中國(guó)條銹生理小種條中29(CYR29)、條中32(CYR32)和條中34(CYR34)。采用“抖粉法”[11]在一葉一心至二葉期的待鑒定小麥葉片上接種。接種之后，將所有鑒定小麥幼苗放置于相對(duì)濕度100 %，溫度8～10 ℃的黑暗保濕桶中保濕24 h。隨后移至低溫溫室潛育發(fā)病，期間溫度控制在15～18 ℃，光照16 h/d，光強(qiáng)9000 lx，相對(duì)濕度70 %～80 %，以銘賢169為感病對(duì)照。接種后15～18 d，待銘賢169表現(xiàn)較高的感病性，發(fā)病充分，按照0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[12]讀取并記錄各材料的反應(yīng)型(infection type，IT)，侵染型0～6級(jí)為抗病，7～9級(jí)為感病。所有材料設(shè)2個(gè)獨(dú)立的重復(fù)。

1.2.2 分子檢測(cè) 分子檢測(cè)在西寧西北高原生物研究所內(nèi)中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將參試材料播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，待出苗后，每品種取幼苗葉片約100 mg，用改良的2×CTAB法[13]提取液提取葉片基因組DNA。用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度，并稀釋成50 ng/μl，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 Yr基因的側(cè)翼標(biāo)記名稱及序列Table 1 Name and sequence of flanking markers for Yr genes used in this study

利用Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26側(cè)翼分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)[14-24]。所有引物均由上海生物工程有限公司合成(表1)。

PCR反應(yīng)體系(總體積10 μl)：5 μl 2×PCR Master Mix(Sangon Biotech，中國(guó)上海)；DNA模板0.2 μl；10 mM/L的上、下游引物各0.4 μl；ddH2O 4 μl。PCR擴(kuò)增程序：擴(kuò)增反應(yīng)在Applied Biosystems PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))上進(jìn)行，94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度參考Grain Genes 2.0(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃冰箱保存。

標(biāo)記AF1/AF4的PCR產(chǎn)物采用1 %(w/v)瓊脂糖凝膠電泳；標(biāo)記SC200、Xpsp3000、Xbarc8、Cslv34、Xgwn295的PCR產(chǎn)物采用3 %(w/v)瓊脂糖凝膠電泳；其余標(biāo)記的PCR產(chǎn)物采用8 %(w/v)非變性丙烯酰胺凝膠電泳，后經(jīng)溴化乙錠染色檢測(cè)，利用紫外成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))觀察并拍照，其中Xgwm413采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)(委托上海生物工程有限公司完成)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期抗病性鑒定

苗期接種鑒定結(jié)果表明：對(duì)CYR29菌系表現(xiàn)抗性的材料有174份(占88.3 %)，對(duì)CYR32菌系表現(xiàn)抗性的材料有86份(占43.6 %)，對(duì)CYR34菌系表現(xiàn)抗性的材料有122份(占61.9 %)；對(duì)CYR29和CYR32同時(shí)表現(xiàn)抗性的材料有81份(占41.1 %)，對(duì)CYR29和CYR34同時(shí)表現(xiàn)抗性的材料有119份(占60.4 %)，對(duì)CYR32和CYR34同時(shí)表現(xiàn)抗性的材料有75份(占38.0 %)；對(duì)這3個(gè)生理小種均表現(xiàn)抗病的材料有74份(占37.5 %)，其余73份參試材料對(duì)CYR29、CYR32和CYR34表現(xiàn)感病(表2)。

圖1 部分供試材料條銹病抗病基因的分子檢測(cè)Fig.1 Detection of molecular markers linked to the strip rust resistance genes in some of tested cultivars

抗病鑒定結(jié)果表明，參試小麥在苗期對(duì)當(dāng)前條銹菌流行小種具有較好的抗病性，但整體抗性水平較低。條銹菌小種CYR34致病的有75份，CYR29致病的有23份，CYR32致病的有111份。對(duì)CYR32表現(xiàn)感病的小麥品種(系)的數(shù)量最多。

2.2 分子檢測(cè)結(jié)果與分析

2.2.1Yr5的分子檢測(cè) 利用Somers D J[14]和Murphy[15]開(kāi)發(fā)的Yr5的側(cè)翼標(biāo)記SSR標(biāo)記XBarc167和XBarc349對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，含有Yr5的材料分別可以擴(kuò)增出260 和105 bp的特征條帶。結(jié)果表明：青麥1號(hào)、周91177等21份材料可檢測(cè)出與Yr5近等基因系A(chǔ)vocet S*6/Yr5大小相似的特征條帶，占供試材料的10.6 %(表2，圖1)。

2.2.2Yr9的分子檢測(cè) 利用Francis[16]開(kāi)發(fā)的SCAR標(biāo)記AF1/AF4和Weng[17]開(kāi)發(fā)的標(biāo)記Xgwm582分別進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：高原182、高原356、民和588等33份材料檢測(cè)出與Yr9近等基因系A(chǔ)vocet S*6/Yr9大小相似的特異性條帶，占供試材料的16.7 %(表2，圖1)。

2.2.3Yr10的分子檢測(cè) 利用SCAR標(biāo)記SC200和Xpsp3000(Shao等[18]，Wang等[19])進(jìn)行Yr10檢測(cè)，結(jié)果表明，僅大麥子、定西24和德抗961等幾個(gè)品種被檢測(cè)出與Yr10的近等基因系A(chǔ)vocet S*6/Yr10相似大小的特征帶，占供試材料的1.5 %(表2，圖1)。

2.2.4Yr15的分子檢測(cè) 用Yr15的SSR標(biāo)記[15]檢測(cè)結(jié)果表明，寧春26、高原V028、青春524、高原158等28份小麥材料可檢測(cè)出與Yr15的近等基因系A(chǔ)vocet S*6/Yr15大小相似的特征條帶，占供試材料的14.2 %(表2，圖1)。

2.2.5Yr18的分子檢測(cè)Yr18是與Sr34、Lr34、Pm38緊密連鎖的慢銹性基因[20]。用STS、SSR標(biāo)記Cslv34[21]和Xgwm295[22-23]檢測(cè)，結(jié)果表明：高原182、高原363、永3388、定西87-17、永良15和關(guān)東107等6份材料檢有與Avocet S*6/Yr18大小相似的特征條帶，占供試材料的3.0 %(表2，圖1)。

2.2.6Yr26的分子檢測(cè) 利用SSR標(biāo)記Xbarc181[24]、Xgwm11[25]檢測(cè)高原363、高原448、青春570、青春40、E32-1、科農(nóng)9204和輪選701等含有與Yr26的近等基因系A(chǔ)vocet S*6/Yr26大小相似的特征條帶，占供試材料的3.5 %(表2，圖1)。

3 討 論

青海高原地處我國(guó)甘陜川青冬春麥交替種植區(qū)，條銹病常年流行，也是條銹病生理小種極易發(fā)生變化的區(qū)域。春小麥作為青海省的主要糧食作物，占播種面積的70 %左右[26-27]。開(kāi)展抗條銹病育種和品種合理布局對(duì)控制條銹病流行和生理小種變化具有重要意義。

苗期鑒定表明，新致病類型CYR34對(duì)供試材料毒性已經(jīng)超過(guò)CYR29，但尚未超過(guò)當(dāng)前優(yōu)勢(shì)小種CYR32。分子檢測(cè)表明，197份供試材料中可能含有抗性基因Yr5(21份)、Yr9(33份)、Yr10(3份)、Yr15(28份)、Yr18(6份)和Yr26(7份)等基因的材料76份，另外20份材料含有2～3個(gè)抗性基因。

綜合苗期鑒定和分子鑒定結(jié)果，苗期對(duì)CYR29、CYR29 和CYR34均表現(xiàn)抗性的74份材料中，檢測(cè)到含有Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26等基因的材料共38份(占含有抗性基因材料的50 %)；15份材料可能含有2～3個(gè)抗性基因(占含有抗性基因材料的19.7 %，占供試材料多個(gè)基因的75 %)；其余未檢測(cè)到這6個(gè)抗性基因的36份材料可能含有其它抗性基因。

(1)青海省歷年審定品種、現(xiàn)有種植品種抗病水平。通過(guò)對(duì)青海省歷年審定品種、現(xiàn)有大面積種植品種及后備品種等71份小麥材料的分子檢測(cè)(表2，1-71號(hào))：含抗病基因的品種(系)共有20份，約占28.1 %，其中青春254(含Yr15)、青春40(含Yr26)、高原V028(含Yr15)、高原182(含Yr9和Yr18)、高原356(含Yr9)、高原363(含Yr18和Yr26)、青麥1號(hào)(含Yr5)、民和853(含Yr15)、都選001(含Yr5)和山旱901(含Yr9)苗期對(duì)CYR29、CYR29 和CYR34均表現(xiàn)抗性。經(jīng)溯源，抗源主要來(lái)源于墨西哥品種、遠(yuǎn)緣親本和外引材料，并且抗源單一。就目前育種中正在普遍應(yīng)用的Yr5、Yr10和Yr15抗病基因來(lái)看，含這些基因的品種(系)僅10份材料，抗源也多為外引品種和來(lái)自遠(yuǎn)緣成分。例如，青春254采用多父本聚合雜交，父本來(lái)源中含有墨西哥小麥，而高原Vo28品種則是直接引自CCMMYT的高代材料，高原158、高原182分別是普通小麥與多年生1號(hào)(主要外源基因供體親本為八倍體小偃麥品種中3)和小偃系列品種后代(含偃麥草血緣)雜交的后代。青?，F(xiàn)有品種和資源中聚合2個(gè)以上抗病基因的材料僅有4個(gè)。無(wú)論是歷年審定品種、現(xiàn)有品種還是后備品種，都存在抗性基因單一，抗源單一的情況。因此，對(duì)于青海高原小麥育種來(lái)說(shuō)，不但要利用好現(xiàn)有的抗病資源，更要注意引進(jìn)和聚合新的抗病基因。

(2)西北水地參試品種抗病水平。西北春麥區(qū)春小麥水地區(qū)域試驗(yàn)是展示這一地區(qū)育種水平的國(guó)家級(jí)試驗(yàn)，試驗(yàn)地域包括內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、青海、新疆等五省區(qū)，位于我國(guó)西北春麥帶，寧夏培育的寧春4號(hào)成為這一地區(qū)的主栽品種之一。近年來(lái)參試品種主要來(lái)自寧夏農(nóng)科院、內(nèi)蒙古農(nóng)科院、甘肅農(nóng)科院及一些地區(qū)農(nóng)科院所等單位。通過(guò)對(duì)2004-2017年參加區(qū)試、生試的27份小麥品種(表2中第72～98號(hào)材料)的分子檢測(cè)結(jié)果表明，在10個(gè)品種中含有Yr5、Yr15、Yr9、Yr18、Yr26等5個(gè)抗病基因，約占37.04 %，但據(jù)田間多年觀測(cè)，表現(xiàn)抗病的品種只有巴09-520和巴豐6號(hào)，占7.4 %，其余參試品種大多田間表現(xiàn)高感，表明這些地區(qū)仍需加強(qiáng)抗銹品種的培育。

(3)多抗基因Yr18的發(fā)掘利用。Yr18基因具有良好慢銹性，一般在苗期呈感病而在成株期表現(xiàn)抗性，并且抗性更為持久，它與稈銹(Sr34)、葉銹(Lr34)、白粉(Pm38)等[20]多個(gè)抗性基因連鎖，屬“一因多效”的優(yōu)良基因。對(duì)197份小麥材料的檢測(cè)結(jié)果，含該基因的材料有6份(占3.0 %)，比例極低。Yr18與小麥白粉病成株期抗性基因Pm38相連鎖，在參試材料中檢測(cè)到含有Yr18的6份材料田間對(duì)白粉病均呈現(xiàn)良好的抗性。有研究表明，Yr18在農(nóng)家品種中的分布頻率遠(yuǎn)高于育成品種和引進(jìn)品種[28]。因此，在加大對(duì)該基因的利用時(shí)應(yīng)注意對(duì)農(nóng)家種的有效利用。

致謝：本實(shí)驗(yàn)苗期抗病性鑒定是在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院小麥抗病種質(zhì)資源創(chuàng)制與利用研究中心完成，期間得到了詹剛明副教授的大力支持和幫助，謹(jǐn)致謝忱！