文│中國動物疫病預(yù)防控制中心
血清學(xué)檢測技術(shù)因其簡便、低成本和無須特殊的儀器設(shè)備,而成為最常用的檢測技術(shù)。由于非洲豬瘟(ASF)尚沒有可用的疫苗,非洲豬瘟病毒(ASFV)抗體陽性即表明當(dāng)前或者曾經(jīng)發(fā)生了感染。此外,ASFV抗體在感染早期即可出現(xiàn),并持續(xù)數(shù)年。然而,在特急性和急性感染中,豬通常在抗體轉(zhuǎn)為陽性前已死亡。因此,在疫病暴發(fā)的早期階段,建議采集樣品檢測病毒DNA。
對于檢測ASF抗體,推薦使用ELISA篩查抗體陽性樣品,并采取免疫印跡試驗(IB)或間接熒光抗體試驗進(jìn)行確認(rèn)。此外,間接免疫過氧化物酶的抗體檢測技術(shù)也可用作豬血清和組織滲出物中ASF抗體檢測的替代試驗。該技術(shù)也適用于大量樣品的檢測,而無須昂貴的熒光顯微鏡設(shè)備,且敏感性較高。
ELISA是一種常用的檢測技術(shù),廣泛用于多種動物疫病的大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查。該方法的顯著特點(diǎn)是靈敏度高、特異性好、速度快、成本低,結(jié)果清晰。借助于自動化設(shè)備的使用,可以實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速篩選。
ELISA使用標(biāo)記物檢測血清樣品中的ASF抗體。ELISA使用的標(biāo)記通常是某種酶。當(dāng)抗原和抗體彼此結(jié)合時,酶引起底物發(fā)生顏色變化,從而鑒定ASF陽性樣品。目前,多種用于ASF抗體檢測的間接或阻斷ELISA已實(shí)現(xiàn)商品化供應(yīng),或者由實(shí)驗室“自主”建立。
血清處理或保存不當(dāng)(儲存或運(yùn)輸不當(dāng)),如溶血樣品可能會產(chǎn)生高達(dá)20%的假陽性結(jié)果。因此,通過ELISA檢測的所有陽性和可疑樣品必須通過其他血清學(xué)替代試驗確認(rèn)。
IB技術(shù)是用于蛋白質(zhì)檢測和鑒定的快速、靈敏的檢測技術(shù)。IB技術(shù)的原理是抗原抗體的特異性結(jié)合。IB技術(shù)中使用了覆蓋有病毒抗原的紙條,首先是抗原溶解、電泳分離以及轉(zhuǎn)移到薄膜上(通常是硝化纖維素膜),之后與特異性一抗反應(yīng),再與標(biāo)記二抗作用后,產(chǎn)生可直接觀察的陽性反應(yīng)條帶(見圖1)。
◎圖1 通過免疫印跡試驗(IB)檢測ASF抗體
◎圖2 間接熒光抗體(IFA)對ASF抗體的檢測
ASFV感染后首先刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的多種病毒蛋白,通過在IB試驗,可在所有感染動物中標(biāo)定地檢測到。動物感染后7~9天血清轉(zhuǎn)陽,并可在康復(fù)動物體內(nèi)存在幾個月。接種其他病毒疫苗的動物血清,可能會產(chǎn)生非特異性反應(yīng),因此需要借助于如IPT或者FAT等技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。
該技術(shù)的原理是用具有細(xì)胞適應(yīng)性的ASFV毒株,感染單層綠猴腎細(xì)胞,再通過特異性抗原抗體反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對ASF抗體的檢測。抗原抗體反應(yīng)通過耦聯(lián)的熒光素進(jìn)行檢測。陽性樣品在感染細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)特異性熒光。IFA是一種快速、高度敏感和特異的ASF抗體檢測技術(shù),適用于血清、血漿或組織分泌物中抗體的檢測(圖2)。
免疫過氧化物酶試驗(IPT)是一種細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù),細(xì)胞固定后通過耦聯(lián)的過氧化物酶實(shí)現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物的檢測。在IPT反應(yīng)過程中,綠猴腎細(xì)胞感染了適應(yīng)于這些細(xì)胞的ASFV適應(yīng)株。感染細(xì)胞首先被固定,之后用作抗原以確定樣品是否存在針對ASF的特異性抗體。與FAT檢測一樣,IPT是具有高度的敏感性和特異性的快速檢測技術(shù),適用于從血清、血漿或組織滲出液中檢測ASF抗體。但因為采用了酶學(xué)顯色系統(tǒng),其結(jié)果判定比FAT更為簡單(圖3)。
◎圖3 間接免疫氧化物酶試驗(IPT)對ASF抗體的檢測
綜上所述,目前可用的診斷技術(shù)可通過綜合病毒和抗體檢測來確診ASF。實(shí)時熒光PCR是最廣泛應(yīng)用的病毒學(xué)診斷技術(shù),可敏感、特異、快速地實(shí)現(xiàn)ASFV核酸的檢測。
由于存在交叉污染的可能,來自無疫區(qū)的單個動物(例如野豬)的PCR陽性或在一群動物中出現(xiàn)的單個PCR陽性樣品,應(yīng)采取其他的病毒檢測方法,以及結(jié)合血清學(xué)、病理學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果綜合確診。由于PCR所檢測到的陽性是病毒核酸陽性,而不是感染性病毒粒子,因此,在PCR之外,強(qiáng)烈推薦用新的方法確定感染地區(qū)。在報告發(fā)生疫情前,先從感染樣品中分離獲得病毒以確認(rèn)。
雖然經(jīng)過驗證的ELISA是檢測ASF抗體的候選技術(shù),特別是對血清樣品的初步篩查,但應(yīng)時刻注意檢測的局限性。應(yīng)使用其他確證試驗,如IB、IFA或IPT,以發(fā)現(xiàn)ELISA檢測中的假陽性樣品。此外,IFA和IPT是組織滲出液和血漿樣品檢測的首選技術(shù),因為他們能完整展示流行病學(xué)過程,并可確定感染的具體時間。
表1 ASF實(shí)驗室診斷技術(shù)一覽表(譯者注:XXX代表最高,X代表一般)
ASF準(zhǔn)確的診斷必須包括病毒學(xué)和血清學(xué)檢測結(jié)果,同時結(jié)合臨床、病理和流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果。表1總結(jié)了ASF的主要實(shí)驗室診斷技術(shù)及其特性。(注:本文節(jié)選自《聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)動物生產(chǎn)及衛(wèi)生手冊》)