非洲豬瘟的抗體檢測

文│中國動物疫病預(yù)防控制中心

血清學(xué)檢測技術(shù)因其簡便、低成本和無須特殊的儀器設(shè)備，而成為最常用的檢測技術(shù)。由于非洲豬瘟（ASF）尚沒有可用的疫苗，非洲豬瘟病毒（ASFV）抗體陽性即表明當(dāng)前或者曾經(jīng)發(fā)生了感染。此外，ASFV抗體在感染早期即可出現(xiàn)，并持續(xù)數(shù)年。然而，在特急性和急性感染中，豬通常在抗體轉(zhuǎn)為陽性前已死亡。因此，在疫病暴發(fā)的早期階段，建議采集樣品檢測病毒DNA。

對于檢測ASF抗體，推薦使用ELISA篩查抗體陽性樣品，并采取免疫印跡試驗（IB）或間接熒光抗體試驗進(jìn)行確認(rèn)。此外，間接免疫過氧化物酶的抗體檢測技術(shù)也可用作豬血清和組織滲出物中ASF抗體檢測的替代試驗。該技術(shù)也適用于大量樣品的檢測，而無須昂貴的熒光顯微鏡設(shè)備，且敏感性較高。

一、ELISA對非洲豬瘟抗體的檢測

ELISA是一種常用的檢測技術(shù)，廣泛用于多種動物疫病的大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查。該方法的顯著特點(diǎn)是靈敏度高、特異性好、速度快、成本低，結(jié)果清晰。借助于自動化設(shè)備的使用，可以實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速篩選。

ELISA使用標(biāo)記物檢測血清樣品中的ASF抗體。ELISA使用的標(biāo)記通常是某種酶。當(dāng)抗原和抗體彼此結(jié)合時，酶引起底物發(fā)生顏色變化，從而鑒定ASF陽性樣品。目前，多種用于ASF抗體檢測的間接或阻斷ELISA已實(shí)現(xiàn)商品化供應(yīng)，或者由實(shí)驗室“自主”建立。

血清處理或保存不當(dāng)（儲存或運(yùn)輸不當(dāng)），如溶血樣品可能會產(chǎn)生高達(dá)20%的假陽性結(jié)果。因此，通過ELISA檢測的所有陽性和可疑樣品必須通過其他血清學(xué)替代試驗確認(rèn)。

IB技術(shù)是用于蛋白質(zhì)檢測和鑒定的快速、靈敏的檢測技術(shù)。IB技術(shù)的原理是抗原抗體的特異性結(jié)合。IB技術(shù)中使用了覆蓋有病毒抗原的紙條，首先是抗原溶解、電泳分離以及轉(zhuǎn)移到薄膜上（通常是硝化纖維素膜），之后與特異性一抗反應(yīng)，再與標(biāo)記二抗作用后，產(chǎn)生可直接觀察的陽性反應(yīng)條帶（見圖1）。

◎圖1 通過免疫印跡試驗（IB）檢測ASF抗體

◎圖2 間接熒光抗體（IFA）對ASF抗體的檢測

ASFV感染后首先刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的多種病毒蛋白，通過在IB試驗，可在所有感染動物中標(biāo)定地檢測到。動物感染后7～9天血清轉(zhuǎn)陽，并可在康復(fù)動物體內(nèi)存在幾個月。接種其他病毒疫苗的動物血清，可能會產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，因此需要借助于如IPT或者FAT等技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。

二、間接熒光抗體試驗(IFA)對非洲豬瘟抗體的檢測

該技術(shù)的原理是用具有細(xì)胞適應(yīng)性的ASFV毒株，感染單層綠猴腎細(xì)胞，再通過特異性抗原抗體反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對ASF抗體的檢測。抗原抗體反應(yīng)通過耦聯(lián)的熒光素進(jìn)行檢測。陽性樣品在感染細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)特異性熒光。IFA是一種快速、高度敏感和特異的ASF抗體檢測技術(shù)，適用于血清、血漿或組織分泌物中抗體的檢測（圖2）。

三、間接免疫過氧化物酶試驗對非洲豬瘟抗體的檢測

免疫過氧化物酶試驗（IPT）是一種細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)，細(xì)胞固定后通過耦聯(lián)的過氧化物酶實(shí)現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物的檢測。在IPT反應(yīng)過程中，綠猴腎細(xì)胞感染了適應(yīng)于這些細(xì)胞的ASFV適應(yīng)株。感染細(xì)胞首先被固定，之后用作抗原以確定樣品是否存在針對ASF的特異性抗體。與FAT檢測一樣，IPT是具有高度的敏感性和特異性的快速檢測技術(shù)，適用于從血清、血漿或組織滲出液中檢測ASF抗體。但因為采用了酶學(xué)顯色系統(tǒng)，其結(jié)果判定比FAT更為簡單（圖3）。

◎圖3 間接免疫氧化物酶試驗（IPT）對ASF抗體的檢測

綜上所述，目前可用的診斷技術(shù)可通過綜合病毒和抗體檢測來確診ASF。實(shí)時熒光PCR是最廣泛應(yīng)用的病毒學(xué)診斷技術(shù)，可敏感、特異、快速地實(shí)現(xiàn)ASFV核酸的檢測。

由于存在交叉污染的可能，來自無疫區(qū)的單個動物（例如野豬）的PCR陽性或在一群動物中出現(xiàn)的單個PCR陽性樣品，應(yīng)采取其他的病毒檢測方法，以及結(jié)合血清學(xué)、病理學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果綜合確診。由于PCR所檢測到的陽性是病毒核酸陽性，而不是感染性病毒粒子，因此，在PCR之外，強(qiáng)烈推薦用新的方法確定感染地區(qū)。在報告發(fā)生疫情前，先從感染樣品中分離獲得病毒以確認(rèn)。

雖然經(jīng)過驗證的ELISA是檢測ASF抗體的候選技術(shù)，特別是對血清樣品的初步篩查，但應(yīng)時刻注意檢測的局限性。應(yīng)使用其他確證試驗，如IB、IFA或IPT，以發(fā)現(xiàn)ELISA檢測中的假陽性樣品。此外，IFA和IPT是組織滲出液和血漿樣品檢測的首選技術(shù)，因為他們能完整展示流行病學(xué)過程，并可確定感染的具體時間。

表1 ASF實(shí)驗室診斷技術(shù)一覽表（譯者注：XXX代表最高，X代表一般）

ASF準(zhǔn)確的診斷必須包括病毒學(xué)和血清學(xué)檢測結(jié)果，同時結(jié)合臨床、病理和流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果。表1總結(jié)了ASF的主要實(shí)驗室診斷技術(shù)及其特性。（注：本文節(jié)選自《聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）動物生產(chǎn)及衛(wèi)生手冊》）