雙黃連對小鼠白細胞及其分類的影響

文│王莉莉（安徽省阜陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所）

內(nèi)毒素是與細菌細胞壁牢固結(jié)合的一種大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)，主要存在于革蘭氏陰性菌。只有在細菌死亡或繁殖時，才釋放到細胞外，發(fā)揮其各種效應(yīng)，主要化學(xué)成分為脂多糖（LPS），LPS進入機體內(nèi)可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等，嚴重者出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥。LPS主要刺激中性粒細胞、單核/巨噬細胞和B淋巴細胞，可以通過激活單核細胞間接作用于淋巴細胞，誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡。

雙黃連是由金銀花、連翹和黃芩提取的混合液，具有辛涼解表，清熱解毒的功效，已有研究表明雙黃連體外抗內(nèi)毒素效果較好。由于血中細菌或病灶內(nèi)細菌釋放出大量內(nèi)毒素至血液，或輸入大量內(nèi)毒素污染的液體而引起內(nèi)毒素性血癥，產(chǎn)生白細胞反應(yīng)，白細胞數(shù)發(fā)生變化。雙黃連能明顯抑制炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的腫脹和血管通透性增加，對注射內(nèi)毒素引起的發(fā)熱反應(yīng)有明顯的解熱作用，并且呈量效對應(yīng)關(guān)系。雙黃連在體外對中性粒細胞cAMPPDE（PDE為磷酸二酯酶）活性具有顯著的抑制作用，從而使細胞內(nèi)cAMP含量升高，抑制中性粒細胞活化，發(fā)揮抗炎作用。

關(guān)于內(nèi)毒素所致多器官功能衰竭已有許多研究，郭德玉等就內(nèi)毒素導(dǎo)致的大鼠腎功能變化做過試驗。目前，用中草藥拮抗、中和及摧毀內(nèi)毒素從而減輕其病理損傷已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。中草藥復(fù)方如黃連解毒湯可破壞、降解內(nèi)毒素。雙黃連具有廣譜抗菌、抗病毒感染作用及增強機體免疫力等作用，具有重要的研究與應(yīng)用價值。

本試驗使用內(nèi)毒素復(fù)制內(nèi)毒性小鼠模型，探討雙黃連對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠外周血液中白細胞總數(shù)及其分類的影響，旨在為臨床應(yīng)用雙黃連預(yù)防和治療內(nèi)毒素性損傷提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.試驗材料。雙黃連口服液：某公司；內(nèi)毒素：某實驗中心提供菌種，自己培育擴增；染色液：瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液；某牌實驗鼠顆粒飼料：執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T14924.9.2001。

2.試驗儀器。顯微鏡、白細胞計數(shù)器。

3.試驗動物的來源及飼養(yǎng)管理。50日齡健康、SD小鼠50只（體重18～22克），隨機分成五組：空白對照組，試驗對照組，試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組。小鼠每日更換兩次飼料。室溫下飼養(yǎng)，試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組飲水中分別加入的雙黃連口服液1.0毫升/升、4.0毫升/升、16.0毫升/升，對照組供給清潔飲用水；試驗期每兩天更換潔凈墊料一次，試驗場地每周消毒一次；定期稱重，觀察采食、生長發(fā)育情況。飼養(yǎng)場地為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室，飼養(yǎng)場地及器械均嚴格消毒。

4.試驗設(shè)計。50日齡健康、SD小鼠50只隨機分成五組，分別為空白對照組（試驗期僅供飲用水），試驗對照組（試驗期供飲用水，35天后腹腔注射內(nèi)毒素），試驗Ⅰ組（飲水中加入雙黃連1.0毫升/升），試驗Ⅱ組（飲水中加入雙黃連4.0毫升/升），試驗Ⅲ組（飲水中加入雙黃連16.0毫升/升），試驗期間動物自由進食和飲水。35天后試驗對照組和試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組腹腔注射內(nèi)毒素，染毒致傷，復(fù)制急性損傷模型；空白對照組注入等量的生理鹽水。染毒結(jié)束后禁食10小時，12小時后心臟采血，制作血涂片，染色鏡檢。然后用瑞氏染色法進行染色計數(shù)。

表1 小鼠攝入雙黃連對外周血液白細胞分類變化（±SD，n＝10）

表1 小鼠攝入雙黃連對外周血液白細胞分類變化（±SD，n＝10）

注：同列比較，不同大寫字母上標(biāo)表示差異極顯著（P＜0.01）；不同小寫字母上標(biāo)表示差異顯著（P＜0.05）；沒有字母或相同字母表示不顯著。

組別 細胞分類（1 0 9個/升） 白細胞 嗜中性粒細胞 淋巴細胞 嗜酸性粒細胞 嗜堿性粒細胞 單核細胞空白對照組 3 7.8 0±0.8 4 b 1 8.6 0±1.1 4 a 1 5.0 0±0.7 1 ab 1.5 0±0.5 0 1.6 0±0.5 5 a 1.3 0±0.4 5試驗對照組 3 9.2 0±1.0 0 b 2 0.5 0±1.2 2 b 1 4.2 0±1.1 0 a 1.3 0±0.5 5 1.3 0±0;5 5 ab 1.3 0±0.5 5試驗Ⅰ 3 8.4 0±1.1 4 ab 1 9.4 0±0.8 9 a 1 5.4 0±0.5 5 ab 1.6 0±0.5 5 1.2 0±0.5 7 ab 1.0 0±0.6 1試驗Ⅱ 3 9.6 0±1.5 2 a 1 9.8 0±0.8 4 b 1 6.2 0±0.8 4 ab 1.7 0±0.8 4 1.0 0±0.0 0 b 1.3 0±0.4 5試驗Ⅲ 4 1.4 0±1.3 4 a 2 0.2 0±1.3 0 b 1 7.2 0±0.8 4 b 1.8 0±0.4 5 0.9 0±0.2 2 b 1.2 0±0.4 5

5.測定指標(biāo)與方法。

（1）白細胞總數(shù)。采用Wiseman氏稀釋液進行血細胞計數(shù)板法計。

（2）白細胞分類計數(shù)。采用瑞氏染色法進行血片染色，計數(shù)白細胞分類計數(shù)。

6.數(shù)據(jù)處理。試驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，用SPSS17.0軟件分析差異的顯著性，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

二、結(jié)果

分析雙黃連對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠外周血液白細胞總數(shù)及其分類的影響。由表1和圖1可看出：白細胞中空白對照組與試驗II組、III組差異顯著（P＜0.05），而與試驗Ⅰ組差異不顯著；試驗對照組只與試驗III組差異顯著（P＜0.05）。中性粒細胞總數(shù)呈明顯逐漸升高趨勢，空白對照組與試驗對照組差異顯著（P＜0.05）；空白對照組與試驗II組、III組差異顯著（P＜0.05）。淋巴細胞總數(shù)也呈增加趨勢，試驗組間隨雙黃連濃度增多而呈遞增趨勢；試驗對照組與試驗組III組差異顯著（P＜0.05）。嗜酸性細胞也增加但組間數(shù)據(jù)差異不明顯，試驗對照組與試驗Ⅰ組、II組、III組差異均不顯著，試驗組之間差異也不顯著。嗜堿性細胞和單核總數(shù)下降，空白對照組與試驗II組、III組差異顯著（P＜0.05），試驗組之間差異不顯著。單核細胞中對照組與各組之間差異不顯著。

三、討論

1.雙黃連對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠外周血液白細胞總數(shù)的影響。機體外周血中的白細胞包括粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞等，它們通過不同方式不同機制消滅病原、過敏源和參加免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體從而保證機體健康。白細胞是機體免疫機能的主要執(zhí)行者之一，臨床上絕大多數(shù)病例的白細胞總數(shù)實際反映著粒細胞的變化。機體免疫功能低下，導(dǎo)致白細胞不同程度的減少。在正常情況下，機體內(nèi)白細胞總數(shù)和白細胞亞群的百分比是相對穩(wěn)定的。機體發(fā)生炎癥或患有其他疾病時可引起其發(fā)生變化。

急性運動后，機體免疫系統(tǒng)反應(yīng)的一個重要特征是外周血中白細胞的變化，急性運動對免疫細胞的功能也有一定的積極影響，在升高期，有利于機體消滅病原微生物。在試驗過程中，小鼠血液內(nèi)白細胞總數(shù)變化明顯，說明注入內(nèi)毒素后，小鼠組織器官發(fā)生了炎癥反應(yīng)，這與前人的研究結(jié)果一致。同時也說明小鼠內(nèi)毒素性損傷模型復(fù)制成功。而雙黃連口服液具有廣譜抗菌、抗病毒感染及增強機體免疫力等作用。因此當(dāng)試驗Ⅰ組小鼠注射雙黃連后白細胞總數(shù)接近于正常值，試驗Ⅱ組小鼠白細胞增多，與試驗對照組相近。但當(dāng)注射量較大時會產(chǎn)生免疫毒性，此時白細胞總數(shù)又大大增加。

◎圖1 小鼠外周血液白細胞及分類變化

2.雙黃連對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠嗜中性粒細胞的影響。嗜中性粒細胞（也稱嗜中性多核粒細胞）占白細胞的60%～70%，對白細胞總數(shù)的升高或減少影響最大。它的功能是預(yù)防病原體感染并可吞噬或殺滅病原體，是機體主要的免疫細胞，所以當(dāng)身體有炎癥或組織損傷時，首先動用的是嗜中性粒細胞，故先有升高。細菌性炎癥常比其他炎癥升高得明顯。當(dāng)炎癥恢復(fù)或好轉(zhuǎn)時它可下降而至正常范圍。有資料顯示中性粒細胞具有快速地組成自發(fā)凋亡的內(nèi)在生命特征。通過自發(fā)性凋亡這一機制，保持中性粒細胞的正常消亡，使其達到動態(tài)平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在正常生理情況下中性粒細胞被吞噬細胞吞噬清除，在感染的情況下，中性粒細胞自發(fā)性凋亡被延遲，功能也發(fā)生改變，其釋放炎性介質(zhì)，毒性氧基團，蛋白水解酶類等功能增強。本試驗結(jié)果中，中性粒細胞數(shù)量呈上升趨勢，空白對照組與試驗對照組和試驗II組、III組差異顯著（P＜0.05），試驗對照組與試驗Ⅰ組差異顯著，而與試驗Ⅱ組、Ⅲ組差異不顯著。說明中性粒細胞受內(nèi)毒素的影響。當(dāng)小鼠有炎癥反應(yīng)，機體有新增的中性粒細胞，即中性粒細胞的凋亡速度減慢。此時小鼠的自身免疫能力有所提高，可以抵抗感染，減輕內(nèi)毒素的損害作用。

3.雙黃連對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠淋巴細胞的影響。淋巴細胞主要功能是參與多種免疫反應(yīng)，是重要的免疫細胞。成人的淋巴細胞占白細胞的20%～30%。當(dāng)動物體內(nèi)受到病毒感染時常見升高，還會出現(xiàn)形態(tài)異常的淋巴細胞。當(dāng)體內(nèi)炎癥或組織損傷但正在恢復(fù)期時，也會升高。本試驗中，淋巴細胞中試驗對照組與試驗III組差異顯著（P＜0.05），空白對照組與試驗組差異不顯著。淋巴細胞含量隨著雙黃連的增加而逐漸增多，表明小鼠灌服雙黃連口服液后可以增強機體的免疫作用，抗感染能力提高；同時也使T、B細胞所占的比例增大，因此一定劑量的雙黃連可以增強機體免疫力。內(nèi)毒素進入機體后可誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡，破壞淋巴細胞的免疫作用，導(dǎo)致機體的抗感染能力減弱。機體特異性免疫機能破壞，免疫力下降，但又由于機體自身會產(chǎn)生一定的免疫抵制作用，所以試驗對照組淋巴細胞總數(shù)變化不顯著。試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組灌服雙黃連口服液后可使機體免疫力增強，故淋巴細胞總數(shù)呈增長趨勢。

4.雙黃連對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠嗜酸性粒細胞的影響。嗜酸性粒細胞的功能主要在于緩解過敏反應(yīng)和限制炎癥過程。得過敏性疾病、皮膚病、寄生蟲病后嗜酸性粒細胞增多，但由于所占比例較小，一般對總數(shù)影響不大。嗜酸性粒細胞是機體發(fā)病機制中重要的炎癥細胞，參與形成非特異性炎癥。試驗結(jié)果中，嗜酸性粒細胞中對照組與其他各組差異不顯著，試驗組間差異不顯著。細胞數(shù)量總體上升，說明嗜酸性粒細胞受雙黃連的影響，隨雙黃連劑量的增大，嗜酸性粒細胞數(shù)不斷增多，這主要是雙黃連增強了機體對外毒的抵抗作用，減少損害的緣故。

5.雙黃連對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠嗜堿性粒細胞的影響。嗜堿性粒細胞的功能與過敏反應(yīng)有關(guān)。在過敏性疾病、慢性粒細胞性白血病時會有升高，但對總數(shù)的影響更小。本試驗中，嗜堿性粒細胞中空白對照組與試驗Ⅱ組、Ⅲ組差異顯著，試驗組之間差異不顯著。說明試驗中小鼠受雙黃連感染后，其自身組織產(chǎn)生一系列的過敏反應(yīng)，以減輕雙黃連對機體組織的破壞程度。

6.雙黃連對內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠單核細胞的影響。單核細主要是吞噬侵入人體的細菌、病毒、毒物等其他有害物質(zhì)，并清除體內(nèi)的死亡細胞碎片。當(dāng)體內(nèi)有慢性炎癥、病毒感染、風(fēng)濕病或結(jié)核病等情況時常會升高。單核細胞主要依靠趨化因子能否與靶細胞特異性結(jié)合，作用于靶細胞發(fā)揮作用。試驗結(jié)果顯示，單核細胞隨雙黃連劑量的增加而相對減少，試驗中對照組與各試驗組之間差異不顯著。說明雙黃連對機體的微循環(huán)具有一定改善作用，但是其濃度過量會使機體造成一定程度的損害。由此可見，單核細胞可作為一種調(diào)控因子，對免疫反應(yīng)類型及功能進行調(diào)節(jié)，以減少機體損害。

綜上所述，從試驗的結(jié)果顯示小鼠注入內(nèi)毒素后，造成機體急性損傷，使外周血液白細胞總數(shù)上升，尤其嗜中性粒細胞增多，而灌服雙黃連后，白細胞總體呈升高趨勢，淋巴細胞總數(shù)增多。說明雙黃連具有抗內(nèi)毒素的作用，能提高機體免疫力。