美國(guó)國(guó)家家禽改良計(jì)劃標(biāo)準(zhǔn)程序（2014版）—細(xì)菌學(xué)檢查程序（2）

譯校│顧小雪 劉林青 翟新驗(yàn)（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

4 蛋殼大腸菌群的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)程序（細(xì)菌學(xué)檢查程序1～3見(jiàn)本刊2019年3期）

在采集和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中避免樣品污染環(huán)境，所采取的預(yù)防措施以及樣品收集后的正確處理都是至關(guān)重要的。參與蛋殼培養(yǎng)的每位檢驗(yàn)員都必須接受相關(guān)授權(quán)實(shí)驗(yàn)室提供的必要的衛(wèi)生程序、抽樣程序和樣品處理方面的指導(dǎo)。國(guó)家官方機(jī)構(gòu)將保留一份記錄，表明該檢驗(yàn)員已接收過(guò)必要的指導(dǎo)。

（a）樣品選擇。每次采樣時(shí)，從每個(gè)雞群中隨機(jī)抽取三個(gè)裝有消毒雞蛋雞籠頂層的四十枚雞蛋。

（b）拭子處理程序。將拭子用授權(quán)實(shí)驗(yàn)室提供的無(wú)菌乳糖肉湯或其他適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基潤(rùn)濕后，擦拭每枚雞蛋大頭直徑為2.5厘米的圓形區(qū)域。每個(gè)拭子擦拭五個(gè)雞蛋，每四個(gè)拭子裝在一個(gè)由授權(quán)實(shí)驗(yàn)室提供的無(wú)菌、加蓋的試管中。

（1）從含有四個(gè)拭子和乳糖肉湯或其他適當(dāng)培養(yǎng)基的管中，轉(zhuǎn)移1毫升到含有10毫升乳糖的發(fā)酵管中。

（2）37℃孵育48小時(shí)。在孵育24和48小時(shí)后，如酸和氣體的產(chǎn)量為10%或更多，則推測(cè)可能存在大腸菌群。

5 確定衛(wèi)生監(jiān)督計(jì)劃現(xiàn)狀和有效性的程序

以下監(jiān)控程序可以依據(jù)國(guó)家官方機(jī)構(gòu)的要求：

（a）監(jiān)控衛(wèi)生程序的有效性。

（1）定期對(duì)糞便污染的裝箱雞蛋的表面進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

（2）定期對(duì)每個(gè)繁殖群中死于殼內(nèi)的雞蛋樣品進(jìn)行大腸菌群的培養(yǎng)。這樣的蛋也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行沙門氏菌的培養(yǎng)。 沙門氏菌培養(yǎng)期間應(yīng)包括下列步驟：（i）每1000毫升預(yù)增菌肉湯中添加35毫克硫酸亞鐵，以阻斷卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)沙門氏菌的抑制作用；（ii）四硫酸鹽選擇性增菌液、控制競(jìng)爭(zhēng)者平板培養(yǎng)基（XLT4、BGN等）延遲了二次增菌程序以及菌落檢測(cè)。

6 用于支原體細(xì)菌學(xué)檢查的實(shí)驗(yàn)室推薦程序

（a）鼻竇、氣管、氣囊、鼻竇、鼻道、呼吸道滲出液，滑膜液、雞蛋（包括蛋黃、卵黃囊、膜和尿囊液）應(yīng)采用無(wú)菌拭子。無(wú)菌技術(shù)非常重要，因?yàn)槟承┪⑸锟赡懿粫?huì)被本方法中使用的抗菌藥物所抑制。上述部位有時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量組織懸浮液，輸卵管和泄殖腔偶爾也有。組織應(yīng)在10倍于其體積的支原體培養(yǎng)基（MBM）中研磨或混合充分，參見(jiàn)本部分（f）段。為了更好地分離支原體，提交參考實(shí)驗(yàn)室的樣品應(yīng)為：活禽、冷凍新鮮組織和裝有干冰的組織標(biāo)本。

（b）將拭子、金屬環(huán)或0.1毫升組織懸浮液接種至5～10毫升MBM。當(dāng)觀察到生長(zhǎng)跡象（肉湯的pH或濁度降低）時(shí)，根據(jù)需要轉(zhuǎn)移每份肉湯培養(yǎng)物以維持原始分離菌。37℃孵育至少21天，再作為陰性結(jié)果進(jìn)行丟棄。 當(dāng)初次觀察到生長(zhǎng)跡象或在培養(yǎng)后第4天或第5天仍不見(jiàn)生長(zhǎng)時(shí)，將肉湯培養(yǎng)基接種到支原體瓊脂培養(yǎng)基（MAM）中，參見(jiàn)本部分（g）段。幾個(gè)培養(yǎng)物可通過(guò)金屬環(huán)或棉簽接種在一個(gè)平皿上。在高濕度培養(yǎng)箱內(nèi)， 37℃培養(yǎng)3～5天。最好加入5%的二氧化碳或使用點(diǎn)蠟燭的廣口瓶。中央凸起的小的圓形半透明菌落極有可能是支原體。建議使用間接照明和低功率或解剖顯微鏡來(lái)觀察菌落，因?yàn)樗鼈兊闹睆胶苌俪^(guò)0.2～0.3毫米。

（c）分離株必須分型。

（1）如果運(yùn)輸時(shí)間少于2～3天，則分離株可以通過(guò)含有冰袋的MBM進(jìn)行運(yùn)輸。如果運(yùn)輸時(shí)間更長(zhǎng)，則需要用干冰凍結(jié)MBM，或在室溫下運(yùn)輸MAM斜面。分離株在運(yùn)輸前必須有生長(zhǎng)跡象。

（2）分離株可在-20℃ MBM中保存2～3周，或在-68℃保存數(shù)年。

（d）替代培養(yǎng)方法：一種覆蓋增菌培養(yǎng)方法，適用于挑剔和敏感的支原體，特別適用于火雞支原體。

（1）將2～3毫升MAM倒入試管中，傾斜試管，直到形成斜面（約45度）。 其他容器也可使用。

（2）采用足夠的MBM覆蓋斜面，以便使培養(yǎng)基（包括接種物）覆蓋瓊脂斜面。

（3）按本部分（b）段所述的方式對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行孵育。

（4）按本部分（b）段所述的方式對(duì)覆蓋物進(jìn)行孵育和檢驗(yàn)。

（e）培養(yǎng)基的制備。

（1）應(yīng)使用適用于細(xì)胞培養(yǎng)的去離子蒸餾水。

（2）所有的玻璃器皿均應(yīng)采用無(wú)殘留洗滌劑（如Alcojet）仔細(xì)洗滌，并用自來(lái)水中沖洗三次，然后在去離子蒸餾水中漂洗兩次。

（3）添加10%的乙酸鉈溶液至終濃度約1∶4000；但是，高度污染的標(biāo)本可能需要達(dá)到1∶2000的終濃度。除（e）（4）段所述的情況以外，應(yīng)先將乙酸鉈加入去離子蒸餾水中，以防止蛋白質(zhì)沉淀。

（4）如果使用高壓滅菌器，則應(yīng)先將支原體肉湯基質(zhì)、葡萄糖、酚紅和半胱氨酸鹽酸鹽加入到去離子蒸餾水中。

再將高壓滅菌培養(yǎng)基冷卻至45℃或更低后，先加入乙酸鉈，再無(wú)菌加入其余組分。

（5）采用無(wú)菌去離子蒸餾水配制青霉素。

（6）無(wú)菌血清加熱至56℃滅活30分鐘。豬血清可用于分離雞毒支原體、滑液囊支原體、雞霉形體和火雞支原體；而馬血清建議用于分離火雞支原體。

（7）制備1%酚紅溶液。

（8）制備1%NAD（β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或輔酶I）溶液。

（9）制備1%溶液的半胱氨酸鹽酸鹽，用于減少滑液囊支原體生長(zhǎng)的NAD。

（10）在 MAM 中使用純化的瓊脂產(chǎn)品，如諾布爾（特殊瓊脂）。

（11）用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。

（12）滅菌可以通過(guò)兩種方法完成：（i）推薦方法是通過(guò)0.20微米濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，必須使用無(wú)菌技術(shù)；（ii）如條件適宜，當(dāng)按照本節(jié)（e）（4）段所述的步驟進(jìn)行時(shí)，則可以使用高壓滅菌器滅菌，120℃、15磅壓力（103kPa）15分鐘。

（13）培養(yǎng)火雞支原體和雞霉形體時(shí)，可忽略酚紅、葡萄糖和NAD。

（14）當(dāng)從被污染的樣品中分離培養(yǎng)火雞支原體時(shí)，應(yīng)在MBM中加入100單位/毫升的多黏菌素B。

（f）支原體肉湯培養(yǎng)基（Frey）制備方式。在 850～880 毫升去離子蒸餾水中加入：乙酸鉈2.5毫升（1∶4000）；可能受到污染的樣品5毫升（1∶2000）；支原體肉湯基22.5克；水性青霉素500000單位；無(wú)菌血清120～150毫升；酚紅2.5毫升；NAD12.5毫升；半胱氨酸鹽酸鹽12.5毫升；葡萄糖1.0～1.5克；調(diào)節(jié)pH至7.8 過(guò)濾除菌。肉湯可在4℃保存2周，或者在-40℃保存更長(zhǎng)時(shí)間。

（g）支原體瓊脂培養(yǎng)基（Frey）制備方式如下：在850～880毫升去離子蒸餾水中加入：支原體肉湯培養(yǎng)基22.5克；調(diào)節(jié)pH至7.8 ；純化瓊脂12.0克；高壓滅菌后在45℃水浴中冷卻，乙酸鉈2.0毫升（1∶4000）；45℃無(wú)菌血清150毫升；水性青霉素400000單位；NAD12.5毫升；半胱氨酸鹽酸鹽12.5毫升。

（1）輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，將約15毫升培養(yǎng)基倒入每個(gè)平皿中。

（2）在37℃培養(yǎng)箱中堆疊培養(yǎng)皿，最多堆疊2～3個(gè)，培養(yǎng)2小時(shí)，以除去多余的水分。

（3）將倒置的平皿密封捆扎包裝，4℃儲(chǔ)存不超過(guò)15天。

（h）應(yīng)監(jiān)測(cè)新的組分或培養(yǎng)基批次，以補(bǔ)償由于純度濃度、制劑等的變化而導(dǎo)致的制劑變化。新舊培養(yǎng)基都應(yīng)針對(duì)單個(gè)培養(yǎng)物進(jìn)行給定數(shù)量的系列滴定。培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況、大小和菌落數(shù)來(lái)進(jìn)行比較。

7 通過(guò)體內(nèi)生物試驗(yàn)（濃縮）評(píng)估支原體檢測(cè)程序

該程序已被證明，在合適的條件下其靈敏度足以檢測(cè)少于100個(gè)支原體。本部分將對(duì)適當(dāng)條件加以規(guī)定。

（a）獲取至少3周齡且不含雞毒支原體、 滑液囊支原體和火雞支原體的雞或火雞（試驗(yàn)禽），并且以能防止其被任何禽類疾病感染的方式加以運(yùn)輸。

（1）將試驗(yàn)禽飼養(yǎng)在經(jīng)有效清潔和消毒的區(qū)域內(nèi)。

（2）該區(qū)域應(yīng)與其他禽類或動(dòng)物隔離。

（3）照顧試驗(yàn)禽的人員應(yīng)采取必要的預(yù)防措施，以防止其他來(lái)源傳染性禽病的傳播。

（b）用于接種污染組織的試驗(yàn)禽在血清板凝集試驗(yàn)中應(yīng)呈現(xiàn)陰性。

（1）接種后的試驗(yàn)禽類在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均必須與非接種的對(duì)照組禽類進(jìn)行隔離。

（c）應(yīng)從至少四只疑似供體禽中以無(wú)菌方式采集氣管、鼻甲和鼻竇黏膜、肺和竇滲出液、子宮頸、胸部和腹部氣囊組織（包括病變部位）以及部分輸卵管和滑膜液。 在無(wú)菌裝置中，加入四倍組織體積的支原肉湯培養(yǎng)基（Frey），將其與組織混合充分。 可從組織池中制得懸浮液。將所制備的懸浮液在30分鐘內(nèi)接種試驗(yàn)禽。

（1）每個(gè)懸浮液池至少通過(guò)腹部氣囊和眶下竇接種四只試驗(yàn)禽，每個(gè)部位最多接種0.5毫升接種物。

（2）在35天中，應(yīng)每7天采血一次，以鑒定血清轉(zhuǎn)化酶。

（3）35天時(shí)，應(yīng)當(dāng)對(duì)試驗(yàn)禽進(jìn)行剖殺，并進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離和支原體鑒定。應(yīng)當(dāng)特別注意接種部位由支原體損傷引起的典型大體或微觀病變。特別應(yīng)注意典型的總體或微觀支原體病變的接種部位。

（d）當(dāng)出現(xiàn)以下情況時(shí)，供體禽被認(rèn)為受到感染：

（1）當(dāng)檢測(cè)供體禽時(shí)無(wú)論血凝抑制檢測(cè)結(jié)果如何，試驗(yàn)禽支原體血清平板抗體陽(yáng)性，且對(duì)照禽保持血清學(xué)陰性。

（2）試驗(yàn)禽分離到支原體，供體禽支原體血清學(xué)陽(yáng)性，對(duì)照禽血清學(xué)和細(xì)菌分離培養(yǎng)陰性。

（e）實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果可以通過(guò)以下方式驗(yàn)證：對(duì)患病禽材料直接進(jìn)行培養(yǎng)或從疑似禽群接種血清陰性的禽，并將血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果與來(lái)自試驗(yàn)禽的結(jié)果進(jìn)行比較。

8 對(duì)淘汰的雛雞和雛火雞進(jìn)行沙門氏菌細(xì)菌學(xué)檢查的實(shí)驗(yàn)室推薦程序

本部分所述的實(shí)驗(yàn)室程序推薦用于下列淘汰禽的沙門氏菌細(xì)菌學(xué)檢查：蛋雞、肉雞、水禽、觀賞禽和野禽中的雛雞，以及火雞群中的雛火雞。

（a）對(duì)于淘汰雛雞，從未安置在育雛房的25只中隨機(jī)選擇1～5日齡的雛雞，按如下方式制備5份器官池、5份卵黃池和5份腸組織池。對(duì)于雛火雞，從孵出后10天內(nèi)死亡的10只雛火雞樣本中，按如下方式制備器官池、蛋黃池和腸組織池。

（1）器官池：從五只雛雞或兩只雛火雞中分別取1～2克，心、肺、肝、脾組織樣品，充分混合并碾碎。雛雞還應(yīng)包括法氏囊的底壁組織。

（2）卵黃池：從五只雛雞或兩只雛火雞中分別取1～2克未被吸收的卵黃囊樣品，充分混合并碾碎。如果卵黃囊基本上不存在的話，則取整個(gè)卵黃囊蒂的殘余部分。

（3）腸組織池：從五只雛雞或兩只雛火雞中分別取0.5平方厘米的嗉囊壁和5毫米長(zhǎng)的十二指腸、盲腸和回盲連接部，充分混合并碾碎。

（b）以1份組織池與10份肉湯的比例將每個(gè)池轉(zhuǎn)移到四硫酸鹽選擇性培養(yǎng)基（Hajna 或 Mueller-Kauffmann）中。

（c）對(duì)于淘汰雛雞，以5只雞為一組重復(fù)本部分（a）和（b）段的步驟，直到所有25只雞都完成檢查，共產(chǎn)生15個(gè)池（5份器官、5份卵黃和5份腸組織）。對(duì)于雛火雞，以2只為一組重復(fù)本部分（a）和（b）段的步驟，直到所有雛火雞都接受了檢查。

（d）對(duì)四硫酸鹽液進(jìn)行孵育。將器官和卵黃池37℃孵育24小時(shí)，腸組織池在41.5℃孵育。在孵育24和48小時(shí)后分別進(jìn)行檢查。按照描述確認(rèn)疑似菌落。對(duì)所有沙門氏菌陰性的四硫酸鹽肉湯進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。也可以使用菌落轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，作為對(duì)可疑菌落三糖鐵和賴氨酸鐵瓊脂篩選物的補(bǔ)充。