阻塞性睡眠呼吸暫停伴認(rèn)知障礙患者中血清miR-132表達(dá)及意義

王新立，谷 麗，趙麗梅，李 聰，劉桂陽，張 博，王洪杰，李 濤

（1.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濟(jì)南250031；2.威海市市立醫(yī)院耳鼻喉科，山東威海264200）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種以間歇性低氧（intermittent hypoxic，IH）為特征的慢性睡眠障礙性疾病，在成年男女中發(fā)病率分別為4%和2%［1］。由于睡眠片段化和IH可引起一系列病理生理變化，如全身炎癥、內(nèi)皮功能障礙和氧化應(yīng)激等［2］，OSA患者通常存在不同程度的認(rèn)知功能障礙［3-4］，包括記憶、學(xué)習(xí)和注意力等。認(rèn)知功能障礙可引起一系列災(zāi)難性后果，例如社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等，某些OSA患者可能最終發(fā)展為阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）［5］。目前對(duì)于OSA患者認(rèn)知功能障礙的病因機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，認(rèn)知障礙通常會(huì)隨著OSA嚴(yán)重程度而加重，但這種趨勢(shì)不是絕對(duì)的線性關(guān)系［6］。文獻(xiàn)報(bào)道［7］，OSA伴有認(rèn)知功能障礙的患者血清中可能存在相關(guān)的生物標(biāo)志物，miRNA在認(rèn)知功能和OSA相關(guān)疾病中起著重要的作用。近年來，已有報(bào)道表明miR-132與突觸可塑性和認(rèn)知功能損害有關(guān)，血清miR-132的表達(dá)與腦卒中后認(rèn)知功能之間存在顯著相關(guān)性［8］。盡管有大量關(guān)于OSA患者在認(rèn)知功能障礙方面的研究，目前尚無OSA患者認(rèn)知障礙與miR-132相關(guān)性的報(bào)導(dǎo)。本研究通過對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行便攜式睡眠呼吸監(jiān)測(cè)（portable sleep monitor，PM）和蒙特利爾認(rèn)知功能評(píng)分（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）以及血清中miR-132表達(dá)情況進(jìn)行了研究分析，探討miR-132在OSA患者中的表達(dá)意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年1月至2017年12月于濟(jì)南市第四人民醫(yī)院門診明確診斷的、未經(jīng)過治療的睡眠呼吸暫停患者（66例），對(duì)所有患者進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)估。同時(shí)選取同期我院查體中心的健康體檢者，經(jīng)以上檢測(cè)顯示不能診斷為睡眠呼吸暫停且無認(rèn)知功能障礙的患者作為對(duì)照組。根據(jù)檢查結(jié)果分為：①OSAI組，確診OSA且MoCA評(píng)分＜26分；②OSAN組，確診OSA且MoCA評(píng)分≥26分；③HC組，不符合OSA診斷標(biāo)準(zhǔn)且MoCA評(píng)分≥26分。

所有患者的排除標(biāo)準(zhǔn)是：①頭部外傷、中風(fēng)、腦腫瘤和其他腦部疾病；②嚴(yán)重的心血管疾病、慢性阻塞性肺病、肝腎功能不全和興奮劑的使用；③嚴(yán)重焦慮和精神病患者；④日常生活能力嚴(yán)重下降；⑤OSA以外的睡眠障礙，如失眠。所有研究對(duì)象均簽署了本研究的知情同意書，且該項(xiàng)目經(jīng)濟(jì)南市第四人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：LL-201600）。

1.2 資料的收集

收集所有患者的基線資料，包括性別、年齡、既往史、教育水平、體質(zhì)量（kg）、身高（m）等。所有受試者年齡均為30～60歲，各組間的年齡、性別和受教育程度相匹配。所有研究對(duì)象在空腹12 h以上采集肘靜脈血4 mL，EDTA抗凝，采血后3 h分離出血清做樣本。

1.3 OSA診斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)第三版國際睡眠障礙分類（ICSD-3）［9］的最新診斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用的是單獨(dú)滿足C條件：當(dāng)使用PSG或OCST時(shí)，平均值為睡眠期間每小時(shí)發(fā)生15次或更多次重大阻塞性呼吸事件，具體包括阻塞性和混合性呼吸暫停，低通氣或呼吸努力相關(guān)性覺醒，即可診斷為OSA。

1.4 睡眠監(jiān)測(cè)

采用凱迪泰多導(dǎo)睡眠診斷分析系統(tǒng)（型號(hào)：SW-SM2000 CB，中國蘇州）進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)，所有監(jiān)測(cè)均在家里完成，總監(jiān)測(cè)時(shí)間不少于7 h，次日由技術(shù)人員進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。監(jiān)測(cè)前48 h內(nèi)禁止飲用含酒精或含咖啡因的飲料和鎮(zhèn)靜藥物。呼吸暫停低通氣指數(shù)（apnea hypopnea index，AHI）計(jì)算為每小時(shí)睡眠時(shí)呼吸暫停次數(shù)與每小時(shí)睡眠低通氣的次數(shù)的比值［9］。

1.5 認(rèn)知功能評(píng)估及標(biāo)準(zhǔn)

認(rèn)知功能由取得資質(zhì)的專業(yè)人員進(jìn)行評(píng)估，包括視空間與執(zhí)行能力、命名、注意力、語言、抽象、延時(shí)回憶及定向力，總MoCA評(píng)分低于26表示認(rèn)知障礙［10］。在OCST后一天的早餐后1 h進(jìn)行MoCA評(píng)分，以避免血糖波動(dòng)對(duì)檢查結(jié)果的影響。所有上述評(píng)估均在安靜舒適的環(huán)境中進(jìn)行。

1.6 miR-132表達(dá)水平測(cè)定

用miRNeasy血清/血漿試劑盒從血清中提取總RNA，嚴(yán)格按照其說明書操作。用Nano Drop Lite分光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。用miScriptⅡRT Kit（德國Qiagen公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體積為20 μL。用miScript SYBR Green PCR Kit檢測(cè)目標(biāo)miRNA的表達(dá)。在ABI 7500型PCR儀（美國ABI公司）上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，條件為：95℃，15 min，94℃ 15 s 40個(gè)循環(huán)，55℃，30 s，70℃，30 s。在40個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，用公式lg2-ΔCt計(jì)算miR-132的相對(duì)表達(dá)，選取miR-16作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件包（IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)系數(shù)用于分析miR-132的相對(duì)表達(dá)水平與其他變量之間的關(guān)系。采用ROC曲線分析方法，評(píng)價(jià)miR-132對(duì)OSA患者認(rèn)知功能障礙的診斷價(jià)值，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

如表1所示，OSA患者的AHI評(píng)分明顯高于HC組（P＜0.001）。在性別（P=0.744）、年齡（P=0.718）、文化程度（P=0.154）、BMI（P=0.073）、高脂血癥（P=0.438）、高血壓（P=0.129）等指標(biāo)3組間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 三組MoCA量表比較

OSAI組與OSAN組和HC組的MoCA總分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），在視空間與執(zhí)行力、命名能力、注意力、語言能力、抽象能力、記憶力、定向力7個(gè)認(rèn)知域的得分低于后兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；表2）。

2.3 認(rèn)知功能與miR-132表達(dá)水平的相關(guān)性

OSAI患者血清miR-132的相對(duì)表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.001；圖1），Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示miR-132的相對(duì)表達(dá)與MoCA評(píng)分呈正相關(guān)（r=-0.726，P＜0.001；圖2）。

2.4 miR-132對(duì)OSA和OSA認(rèn)知功能障礙的篩查

通過ROC曲線分析血清miR-132相對(duì)表達(dá)量在OSAI和OSA的敏感性和特異性。曲線下面積（AUC）在OSAI的曲線上有顯著性差異（AUC=0.935，95%CI：0.890～0.981，P＜0.001；圖 3）。曲線下面積在OSA組的曲線上有顯著性差異（AUC=0.787，95%CI：0.695～0.879，P＜0.001；圖4）。

表1 三組一般資料比較Table 1 Demographic and clinical characteristics of HC，OSAN，and OSAI groups ［n（%）orX ±S］

表2 三組MoCA量表各認(rèn)知域評(píng)分比較Table 2 Comparison of scores in each cognitive domain of MoCA among the three groups （±s）

表2 三組MoCA量表各認(rèn)知域評(píng)分比較Table 2 Comparison of scores in each cognitive domain of MoCA among the three groups （±s）

HC：Health Control；OSAN：Obstructive Sleep Apnea patients without cognitive impairment；OSAI：Obstructive Sleep Apnea patients with cognitive impairment；MoCA：Montreal Cognitive Assessment.LSD after ANOVA test，1）P＜0.05 between OSAN and OSAI group；2）P＜0.001 between HC and OSAI group；3）P＜0.001 between OSAN and OSAI group；4）P＜0.05 between HC and OSAI group.

Group Visuospatial/Executive Naming Attention Language Abstraction Delayed Recall Orientation MoCA HC（n=30）4.80±0.48 2.93±0.25 5.50±0.73 2.67±0.55 1.77±0.43 4.33±0.76 5.87±0.35 27.83±1.34 OSAN（n=30）4.46±0.82 2.80±0.48 5.33±0.88 2.67±0.55 1.80±0.41 4.13±0.97 5.80±0.41 26.97±1.19 OSAI（n=36）4.03 ± 0.911）2）2.42 ± 0.601）2）3.11 ± 1.172）3）1.72 ± 0.912）3）1.39 ± 0.641）4）2.03 ± 0.912）3）4.89 ± 1.062）3）19.61 ± 2.692）3）F P 8.348 10.472 65.103 20.045 6.616 70.000 19.579 185.128＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.002＜0.001＜0.001＜0.001

圖1 miR-132的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Analysis of the relative expression level of miR-132

3 討論

圖2 認(rèn)知功能與血清miR-132相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性Fig.2 Correlation between cognitive function and the relative expression level of serum miR-132

OSA是人群中最常見的睡眠障礙之一，表現(xiàn)為在睡眠過程中頻繁打鼾、反復(fù)發(fā)生間歇性缺氧和高碳酸血癥，易引起睡眠結(jié)構(gòu)紊亂、睡眠不足及腦功能受損，導(dǎo)致白天嗜睡過多、認(rèn)知功能障礙等癥狀。OSA患者通常存在不同程度的認(rèn)知功能障礙［3-4］，包括記憶、學(xué)習(xí)和注意力等。我們研究也發(fā)現(xiàn)：OSAI組在視空間與執(zhí)行力、命名能力、注意力、語言能力、抽象能力、記憶力、定向力等7個(gè)認(rèn)知域的得分均低于OSAN組和HC組（P＜0.05），OSA患者在記憶力、學(xué)習(xí)力及注意力等方面存在認(rèn)知功能障礙。

圖3 miR-132與OSAI的ROC曲線Fig.3 ROC representing OSAI diagnostic tests with miR-132

圖4 miR-132與OSA的ROC曲線Fig.4 ROC curve representing OSA diagnostic tests with miR-132

在本研究中我們分別通過凱迪泰多導(dǎo)睡眠診斷分析系統(tǒng)及MoCA對(duì)各組進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)及認(rèn)知障礙評(píng)分。多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)（Polysomnography，PSG）是目前診斷OSA的金標(biāo)準(zhǔn)，具有診斷OSA的可行性、準(zhǔn)確性和有效性等優(yōu)點(diǎn)［11］，研究結(jié)果也表明OSA患者的AHI評(píng)分（t=-16.49，P＜0.001）明顯高于HC組，說明PM對(duì)OSA的診斷率較高。MoCA是當(dāng)前的國際認(rèn)知篩選量表中應(yīng)用最廣泛的量表之一［12］，可快速識(shí)別患者認(rèn)知功能障礙，具有高靈敏度和簡單、快速和可重復(fù)性、可行性等特點(diǎn)，故本研究通過采用MoCA對(duì)各組進(jìn)行認(rèn)知障礙評(píng)估。但是，MoCA分?jǐn)?shù)易受性別、年齡和教育程度的影響。在這項(xiàng)研究中，三組患者的性別、年齡和文化程度差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示本研究結(jié)果不受上述因素的影響。我們的數(shù)據(jù)顯示，OSAI組與OSAN組和HC組的MoCA總分均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），表明OSA患者存在一定程度的認(rèn)知功能障礙，尤其是在注意力、記憶力等方面。

越來越多的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明miR-132與認(rèn)知功能障礙之間存在相關(guān)性［13］。miR-132是高度保守的miRNA，其通過轉(zhuǎn)錄因子cAMP結(jié)合蛋白從人染色體17的基因缺口區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［14］。研究發(fā)現(xiàn)，重度抑郁障礙患者外周血miR-132顯著升高，miR-132可能是控制海馬神經(jīng)可塑性和神經(jīng)元存活的關(guān)鍵步驟之一［15］。miR-132是一種重要的活動(dòng)依賴性認(rèn)知調(diào)節(jié)因子，且必須保持在一定范圍內(nèi)表達(dá)，以確保正常的學(xué)習(xí)和記憶形成［16］。相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性miR-132在整個(gè)海馬的興奮性細(xì)胞層中表達(dá)，并且在響應(yīng)于空間學(xué)習(xí)任務(wù)時(shí)可誘導(dǎo)miR132的表達(dá)。此外，miR132是正常的細(xì)胞信號(hào)通路的一部分，其將聯(lián)想學(xué)習(xí)能力與記憶形成相關(guān)聯(lián)，并且其表達(dá)的失調(diào)導(dǎo)致認(rèn)知功能受損［16］。在本研究中，我們招募的66名OSA受試者和30名健康對(duì)照者，年齡、性別、BMI和受教育程度相匹配。我們發(fā)現(xiàn)OSAI組中miR-132表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.001）。此外，miR-132的相對(duì)表達(dá)與MoCA評(píng)分之間的顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.726，P＜0.001），我們推測(cè)miR-132通過調(diào)控某種信號(hào)通路導(dǎo)致OSA患者認(rèn)知功能障礙。同樣利用ROC曲線評(píng)價(jià)miR-132對(duì)OSAI和OSA的診斷價(jià)值，曲線下面積分別為0.935、0.787，其靈敏度及特異度均較高，提示miR-132有可能作為OSAI和OSA的診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

在這項(xiàng)研究中，盡管年齡、性別、教育水平相匹配，但仍有一些局限性問題需要解決，例如：①將兒童OSA排除在外；②在特定時(shí)間窗口獲得基因表達(dá)變化的限制同樣性，只有在兩組與其年齡、性別和教育水平相匹配時(shí)才觀察到高度逆相關(guān)，認(rèn)知評(píng)分與血清中的miR-132表達(dá)水平之間也需要未來的研究與更大的隊(duì)列來定義他們的具體關(guān)系。因此，需要對(duì)不同人群和不同年齡的患者進(jìn)行前瞻性調(diào)查，也需要相應(yīng)的MRI、fMRI等圖像支持。

血清miR-132表達(dá)水平升高與OSA診斷及其認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。在我們的研究中，血清miR-132的檢測(cè)有可能成為OSA患者認(rèn)知功能障礙及診斷的一個(gè)潛在指標(biāo)，但對(duì)于血清miR-132如何具體參與OSA的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。