PD-1/PD-L1及Treg細胞在JAK2 V617F陽性骨髓增殖性腫瘤中的表達及意義

成志勇，張麗軍，付建珠，劉 芳，顏曉燕，孫立娜，孫雪珊，王素云

（1.保定市第一醫(yī)院血液內(nèi)科，河北保定071000；2.承德醫(yī)學院研究生院，河北承德067000；3.保定市兒童醫(yī)院病理科，河北保定071000；4.河北省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，河北石家莊050000）

程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）主要表達于活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞表面，與細胞凋亡密切相關［1］。程序性死亡配體-1（programmed death-ligand 1，PD-L1）是PD-1的配體，主要表達于抗原遞呈細胞（APC）及腫瘤細胞［2］。免疫應答過程中，腫瘤細胞及APC將腫瘤抗原遞呈至T細胞后，可刺激其淋巴細胞表達PD-1，募集細胞內(nèi)SHP-2磷酸酶，通過阻斷抗凋亡因子Bcl-xL的表達，抑制T、B細胞增殖，傳遞免疫抑制信號，形成免疫抑制的微環(huán)境［3］。同時腫瘤細胞表面的PD-L1表達水平也在PD-1與促炎癥因子的誘導下上調(diào)，增強腫瘤細胞抗殺傷的能力，起到免疫負調(diào)控作用［4］。在腫瘤患者的T淋巴細胞中，調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）所占比例明顯升高，并抑制具有抗腫瘤活性效應的T淋巴細胞［5］。PD-1/PD-L1信號通路在Treg細胞的生成過程中起誘導促進作用［6］。研究表明，在多種惡性腫瘤中過度表達PD-L1和或PD-1，導致Treg活性增強，并與不良預后相關［3-4］。在不同類型白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤等惡性血液病患者中亦存在PD-1及PD-L1表達［7-8］，PD-1抑制劑nivolumab在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤的治療上已經(jīng)取得成功［2，7］。在髓系惡性腫瘤中，抗PD-1單克隆抗體協(xié)同去甲基化藥物用于治療急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征［9］，具有良好療效，而在骨髓增殖性腫瘤中目前尚未有相關報道。骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是一系或多系分化相對成熟的骨髓細胞克隆性增殖所致的一組腫瘤性疾病。在大部分真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）及半數(shù)原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythema，ET）、原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）患者存在 JAK2 V617F突變。該突變導致酪氨酸激酶過度活化并持續(xù)激活JAK/STAT信號通路［10］。本研究探討了PD-1/PD-L1及CD4+/CD8+比值、Treg在JAK2 V617F突變陽性MPN患者骨髓中的表達及其相互關系，為MPN靶向治療及評價療效提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2016年1月至2018年3月于保定市第一醫(yī)院、河北省人民醫(yī)院收治的45例JAK2 V617F突變陽性的MPN患者，其中男22例，女23例，年齡30～82歲，中位年齡55歲。其中ET 17例（男7例，女10例）、PV 13例（男7例，女6例）、PMF 15例（男8例，女7例）；包括初治組30例（男14例，女16例）、治療組15例（男8例，女7例）。對照組（健康志愿者）15例（男8例，女7例，中位年齡55歲）。其診斷均符合2016 WHO血液病診斷標準。所有患者均知情同意，研究方案均通過保定市第一醫(yī)院倫理委員會批準（批準文號2012 0701）。

治療組所用治療方案：應用干擾素-α2b（Interferon-α2b，IFN-α2b）皮下或肌肉注射，300 U/次，3～7次/周，至少應用6個月以上，必要時應用羥基脲調(diào)整白細胞、血紅蛋白及血小板數(shù)量。

1.2 主要試劑

p-JAK2、PD-1、PD-L1 抗 體 購 自 美 國Proteintech生物技術有限公司；FITC標記的CD3、CD4、CD8單抗，PE標記的CD25單抗及APC標記的Foxp3單抗購自美國BD公司。血液基因組DNA提取試劑盒購自北京博邁德生化科技有限公司；引物序列根據(jù)NCBI公布的相應基因序列設計并由北京賽百盛公司合成；TaqMan購自ABI公司。

1.3 實時熒光定量PCR

①采集新鮮骨髓液4 mL，肝素抗凝。②DNA提取試劑盒提取基因組DNA。③實時熒光定量PCR反應：反應體系共25 μL。反應條件為50℃2 min，95℃10 min一個循環(huán)，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)，同時設標準品和空白對照。PCR反應前3～15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，調(diào)節(jié)基線至適宜處作為閾值，各熒光信號到達所設定的閾值的循環(huán)數(shù)即為Ct值。根據(jù)標準品計算JAK2和JAK2 V617F的絕對拷貝數(shù)量。計算JAK2 V617F/JAK2比值。PCR引物序列及探針如下：JAK2 上游引物：5′-CAG CAA GTA TGA TGA GCA AGC TTT-3′，下游引物：5′-TGA ACC AGA ATA TTC TCG TCT CCA C-3′，MGB-Probe 5′-FAM-TCA CAA GCA TTT GGT TTT-MGB-3′，JAK2 V617F 下游引物：5′-CCA GAA TAT TCT CGT CTC CAC TGA A-3′。

1.4 免疫組織化學染色

組織蠟塊4 μm切片，45℃烤片3 h，脫蠟，蒸餾水沖洗2遍，抗原修復后加3%過氧化氫，阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶的活性，PBS沖洗3次，加入一抗（p-JAK2、VEGF、CD105，工作濃度分別為 1∶200、1∶200、1∶50、）4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加Elivision plus試劑盒中試劑A（增強劑）、試劑B（酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物），PBS沖洗后，加DAB顯色，以胞膜或胞漿或胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標準，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封片。

免疫組化判定標準：以細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色染色顆粒為陽性。選取3個高倍鏡視野區(qū)域（×400）計數(shù)陽性細胞數(shù)占全部細胞的比例。

1.5 流式細胞術淋巴細胞亞群及Treg細胞檢測

外周血單個核細胞中加入熒光素標記的單克隆抗體CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3和小鼠IgG1-FITC及小鼠IgG2-PE做為對照（美國BD公司）直接標記全血細胞，溶血素溶解紅細胞，PBS洗滌2次，流式細胞儀（美國BD公司）檢測淋巴細胞，CellQuest軟件獲取分析細胞進行分析，計算CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.00統(tǒng)計軟件分析處理。免疫組化及淋巴細胞亞群數(shù)據(jù)各組之間比較，其中p-JAK2、CD 8%方差齊，故差異選用方差分析，各組間兩兩比較選用q檢驗；其余各檢測指標經(jīng)檢驗方差不齊，故差異選用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis檢驗）。Pearson線性相關分析JAK2 V617F突變量與PD-1、PD-L1、CD4+/CD8+、Treg細胞之間的相關性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 JAK2 V617F突變在患者中的表達情況

所有患者在初次治療時均經(jīng)定量PCR檢測為JAK2 V617F突變陽性，患者突變量在30%～96%之間。其中初治組30例，突變量（52±18）%，干擾素治療組15例，突變量（39±17）%，前者明顯高于后者，P＜0.05。對照組均未檢測到JAK2 V617F突變。

2.2 免疫組織化學染色檢測p-JAK2、PD-1/PDL1在MPN患者中的表達水平

p-JAK2、PD-1、PD-L1蛋白均表達于細胞膜及細胞質(zhì)，三者骨髓細胞中陽性率在初治組（分別為80±23、50±24、55±21）中表達最高，其次為治療組（分別為58±18、26±16、31±16），對照組（分別為41±13、6±3、5±4）表達最低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01；圖1，表1）。

2.3 淋巴細胞亞群及Treg細胞在各組中的表達水平

初治組、治療組和對照組淋巴細胞亞群結果顯示：CD4+T細胞及CD4+/CD8+初治組低于治療組和對照組（P均＜0.05），治療組低于對照組（P＜0.05）。CD8+T細胞初治組高于治療組和對照組（P均＜0.05），治療組高于對照組（P＜0.05；表2）。初治組、治療組和對照組Treg細胞結果顯示：3組之間均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），其中初治組（14±7）%高于治療組（7±4）%和對照組（1.78±0.96）%，治療組高于對照組（表2）。

圖1 免疫組織化學染色檢測p-JAK2、PD-1、PD-L1表達水平Fig.1 Immunohistochemical staining analysis of the expression levels of p-JAK2，PD-1 and PD-L1 protein

表1 初治組、治療組及對照組JAK2 V617F與PD-1及PD-L1表達結果Table 1 The expression levels of JAK2 V617F and PD-1，PD-L1 in newly diagnosed group，treatment group and control group （X ±S，%）

2.4 JAK2 V617F突變量與PD-1、PD-L1、CD4+/CD8+、Treg細胞相關分析

Pearson線性相關分析顯示初治MPN患者的JAK2 V617F突變量與PD-1、PD-L1正相關，與CD4+/CD8+負相關（r=0.593，P＜0.01；r=0.723，P＜0.01；r=-0.771，P＜0.01），與Treg細胞比例無相關性（P＞0.05）。PD-1與PD-L1正相關（r=0.561，P＜0.01），PD-L1與CD4+/CD8+比值負相關（r=-0.585，P＜0.01），而PD-1、PD-L1與Treg細胞比例均無明顯相關性（P＞0.05）。

表2 各組外周血淋巴細胞亞群及Treg細胞檢測結果Table.2 Peripheral lymphocyte subsets and Treg cell test results （X ±S，%）

3 討論

JAK2 V617F點突變?yōu)镻h染色體陰性MPN患者常見的基因突變，該突變在缺少細胞因子情況下導致JAK2磷酸化，從而誘發(fā)腫瘤［10］。本研究所選45例患者（包括初治組30例，治療組15例）均為JAK2 V617F突變陽性。

PD-1及PD-L1可表達于多種腫瘤表面的共抑制分子，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。研究表明，其在介導多種實體腫瘤細胞免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。在多種白血病、骨髓瘤及淋巴瘤等惡性血液病中存在PD-1及PD-L1高表達［7-9］。本研究顯示，在MPN患者骨髓髓系細胞中，亦存在PD-1及PD-L1高表達，同時與JAK2 V617F突變量正相關。

在人體免疫應答中，腫瘤細胞及APC將腫瘤抗原遞呈至T細胞后，可刺激其淋巴細胞表面的PD-1的表達，進而抑制T、B細胞增殖，并傳遞免疫抑制信號，形成免疫抑制的微環(huán)境［1-3］。本研究顯示，除PD-L1表達于骨髓增殖性腫瘤細胞表面外，在腫瘤細胞中同時存在PD-1高表達，同時PD-L1與PD-1兩者正相關。分析原因，可能存在PD-1伴隨PD-L1表達，或可能與PD-L1相互結合，亦傳遞抑制信號，進而抑制骨髓內(nèi)淋巴細胞活化，形成免疫抑制微環(huán)境，促進MPN細胞生長。

PD-1/PD-L1通路協(xié)助腫瘤免疫逃逸的具體機制可能包括①誘導T細胞耐受；②抑制T細胞增殖及活化；③減少細胞因子的分泌；④增強Treg細胞的功能；⑤阻斷抗原呈遞過程［11］。研究表明在多種腫瘤患者的T淋巴細胞中，Treg細胞所占比例明顯升高，且具有抗腫瘤活性效應的T淋巴細胞受其抑制［5］。此外，PD-1/PD-L1信號通路在Treg細胞的生成過程中起誘導促進作用，同時參與了Treg細胞的抑制功能［12］。JAK-STAT傳導路徑廣泛參與CD4+T細胞的分化，有研究表明在TGF-β和IL-2作用下通過JAK-STAT調(diào)控Treg細胞分化。同時JAK-STAT信號通路活化能夠上調(diào)PD-L1的表達。轉(zhuǎn)錄因子STAT可直接結合到PD-L1的啟動子區(qū)，從而促進PD-L1的轉(zhuǎn)錄［5］。本研究表明，在初治MPN中存在PD-1及PD-L1高表達，同時存在CD4+/CD8+比例倒置及Treg細胞表達明顯高于治療組及對照組，PD-1及PD-L1與CD4+/CD8+比值均存在負相關，雖然未檢測到JAK2 V617F及PD-1、PD-L1與Treg細胞的相關性，可能與標本量少有關。

干擾素在不同腫瘤中的其作用機制及與PD-1/PD-L1之間的相互關系尚不明確。在部分胃腺癌細胞中，干擾素γ能夠誘導PD-L1表達，進而促進T細胞凋亡，而阻斷PD-L1可以逆轉(zhuǎn)了上述效應［13］。而在肺癌惡性胸腔積液中，高表達PD-Ll轉(zhuǎn)基因細胞可顯著抑制干擾素γ的分泌，并誘導CD8+T細胞凋亡［14］。在MPN患者中，應用IFN-α 2b后，約80%的患者可獲得血液學反應，能夠減少JAK2 V617F突變量，甚至部分患者能夠達到分子生物學緩解［15］。本研究結果顯示，在JAK2 V617F陽性MPN患者在應用IFN-α2b后JAK2 V617F突變量明顯減少，同時PD-1/PD-L1及Treg細胞比例同樣表達下調(diào)。

通過本研究，我們初步探討了JAK2 V617F陽性MPN中PD-1/PD-L1及CD4+/CD8+比值、Treg細胞比例與JAK2 V617F突變量的相互關系，為靶向MPN提供了理論依據(jù)。