早發(fā)性家族性阿爾茨海默病家系的臨床表型及基因突變分析

李燕坤，莊順芝，何 菲，陳禮錕，張停亭，崔理立，李才明

（1.廣東醫(yī)科大學，廣東湛江524000；2.惠州市第一人民醫(yī)院神經內科，廣東惠州 516003；3.南方醫(yī)科大學遺傳學教研室，廣東廣州 510515）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是老年癡呆中最常見的一種［1］，是以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的神經系統變性疾?。?］。人群發(fā)病率為1.0%～2.0%，并隨著年齡增長而增高［3］。AD以65歲為界可分為早發(fā)性（early-onset AD，EOAD）和晚發(fā)性（late-onset AD，LOAD）2種，其中LOAD大約占94%。AD還可以依據是否與家族發(fā)病有關劃分為家族性（familiar AD，FAD）和散發(fā)性（sporadic AD，SAD）［4］。在 LOAD 中以SAD的為主，在EOAD中則以FAD居多。目前已證實報道的β淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，App）、早老素蛋白1（presenilin 1，PS1）、早老素蛋白2（presenilin 2，PS2）三個基因的突變是引起EOFAD的重要遺傳致病因素［5-7］。目前我國有關EOFAD的遺傳和臨床資料報道不多?，F我們發(fā)現一例EOFAD，并收集家系成員的臨床資料及相關信息，對患者及其家系成員進行AD相關基因檢測和比對，結合國內外相關文獻，探討基因突變引起該家系EOFAD的臨床表型與遺傳學特點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集

對該EOFAD家系先證者進行病史采集、神經系統體格檢查、顱腦磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、腦電圖、認知功能和精神狀態(tài)檢查，征得該患者與家系成員知情同意后，并將其與家系成員采血后送基因公司進行全外顯子組基因檢測；對12名家系成員進行病史采集、神經系統體格檢查，TTC3基因檢測。應用簡易精神狀態(tài)檢查量表（mimi-mental state examination，MMSE）、蒙特利爾認知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）進 行 評 分 ，其 中MMSE評分標準為：總分0～30分，文盲組≤17分、小學組≤20分、中學以上≤24分則提示異常，MoCA評分標準：滿分30分，≥26分屬于正常。采用美國國立神經病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關疾病學會標準進行AD的診斷。

1.2 基因檢測

采集Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ6、Ⅱ7、Ⅱ8、Ⅱ9、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6的外周血標本各約5 mL，放置于EDTA抗凝管中。其中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ3、Ⅱ7四人的血樣送基因測序公司進行全外顯子檢測，確認可能引起EOFAD的基因突變位點。根據先證者的基因檢測結果，對其余家系成員針對先證者的突變的基因進行檢測。

2 結果

2.1 臨床特征

該家系共有17名成員（圖1），漢族，居住于廣東省惠州市，其中男性9名，女性8名，其中一位成員于2017年3月因外傷意外死亡（Ⅱ5），家系中有4例AD患者（Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ8），家系中AD患者符合AD相關疾病臨床癥狀或體征。同時該家系符合EOFAD家系的臨床診斷標準，屬常染色體顯性遺傳。

圖1 EOFAD家系譜圖Fig.1 Pedigree of EOFAD

先證者（Ⅱ3）為男性，39歲，因“反應遲鈍伴記憶力減退3年”于2016年10月9日步行入院后收治于本科?；颊哂?年前無明顯誘因開始出現反應遲鈍，伴記憶力減退（短期記憶能力下降），性格改變（孤僻），一般生活能自理，能自行走路。查體：意識清楚，對答欠切題，查體尚合作，理解力、定向力、判斷力、計算力、記憶力均減退，心肺腹查體無特殊。雙側指鼻試驗、快速輪替試驗笨拙；雙側跟膝脛試驗基本正常，閉目難立征可疑陽性，無神經系統局灶性缺損體征，MMSE得分19/30分（定向能力7/10分，語言功能7/8分，計算力1/5分，詞語即刻回憶3/3分，延遲回憶1/3分，結構模仿0/1分），蒙特利爾認知評估評分18/30（視空間與執(zhí)行能力2/5分，命名3/3分，注意5/6分，語言1/3分，抽象1/2分，延遲回憶2/5分，定向4/6分）（初中文化水平）。腦脊液檢測及其余生化常規(guī)檢查等均無明顯異常。MRI結果示：幕上腦室系統普遍性輕度擴大，腦溝腦池增寬，腦實質內未見異常信號灶。MRI診斷為大腦彌漫性腦萎縮（圖2A）；MRS結果示：單體素，多腦葉多興趣區(qū)采樣示NAA峰較普遍性降低，但尚存在；部分Cho增高；其中左側顳葉興趣區(qū)NAA/Cr 1.34，Cho/Cr 1.13，NAA/Cho。幕上腦室系統擴大，腦溝腦池增寬。MRS結果提示神經元變性類疾病（圖2B）。出院后規(guī)律服藥：每晚多奈哌齊5 mg、奧氮平2.5 mg（因患者伴有性格改變，孤僻行為，不愿意與親戚交往，懼怕他人傷害他）。2018年4月隨訪結果：患者曾走失2次，精神狀態(tài)較前好轉，能與人打招呼，但智力水平明顯下降。

先證者之母（Ⅰ2），67歲，2年前外傷后發(fā)現“腦萎縮”，近兩年發(fā)現智力下降，記憶力下降，偶爾交流不了，言語不流利，查體：行走緩慢，Rossolimo征陽性，雙跟膝脛可疑陽性，心肺腹查體無明顯異常。MMSE得分25/30分（定向能力9/10分，語言功能7/8分，計算力4/5分，詞語即刻回憶3/3分，延遲回憶2/3分，結構模仿0/1分），蒙特利爾認知評估評分18/30分，（視空間與執(zhí)行能力1/5分，命名3/3分，注意5/6分，語言1/3分，抽象2/2分，延遲回憶1/5分，定向5/6分）（初中文化水平）已確診為AD，病情較重，目前需人照顧。

圖2 家系成員的影像學檢測Fig.2 Imaging examination results of family members

Ⅱ2，43歲，女性，30歲左右逐漸出現反應遲鈍，記憶力下降。于2016年10月因偶發(fā)頭暈半年就診，偶發(fā)頭痛，無其他特殊不適，前年在外院行頭顱CT檢查無異常，現入院后行頭顱CT檢查示雙側大小腦半球對稱，腦干形態(tài)保持，腦實質未見明顯異常密度灶。腦中線結構居中，腦室系統擴大，腦溝、裂、池增寬，顱板下未見異常密度影。CT診斷為腦萎縮（圖2C）。蒙特利爾認知評估評分18/30分（視空間與執(zhí)行能力1/5分，命名2/3分，注意4/6分，語言2/3分，抽象2/2分，延遲回憶2/5分，定向5/6分）（初中文化），已確診為AD，出院后予規(guī)律服藥（每晚多奈哌齊5 mg）。2018年4月隨訪：病情進展嚴重，記憶力明顯下降，患者因經濟關系未完善MMSE、MoCA、頭顱MR或CT等檢查。目前生活不能自理，需家屬照顧。

Ⅱ5，37歲，女性，于2017年3月因外傷意外死亡，26歲時開始發(fā)病，去世前僅相當于5～6歲的智商，記憶力、計算力下降，言語表達不清，呆滯，走路不穩(wěn)，大小便失禁，生活不能自理，查體：神智不清，言語含糊，右眼瞼下垂，左眼球外展、內收障礙，瞳孔大小左側：3 mm，右側：2 mm。對光反射消失。雙手輪轉笨拙，左手明顯，雙上肢腱反射減退，雙下肢腱反射消失，心肺腹查體無明顯異常。MMSE得分16/30分（定向能力4/10分，語言功能8/8分，計算力1/5分，詞語即刻回憶1/3分，延遲回憶1/3分，結構模仿1/1分），蒙特利爾認知評估評分12/30分（視空間與執(zhí)行能力2/5分，命名2/3分，注意3/6分，語言0/3分，抽象0/2分，延遲回憶4/5分，定向1/6分）（高中文化），確診為AD。

Ⅱ7，女性，35歲，目前暫為家系第Ⅱ代中正常人，無明顯相關疾病表現，2016年頭顱CT無異常，2018年復查頭顱CT無異常，仍需繼續(xù)跟蹤隨訪。

Ⅱ8，男性，31歲，30歲時發(fā)病，逐漸出現反應遲鈍，記憶力下降，暫無性格改變，生活能夠自理，查體無明顯異常，顱腦CT平掃示：雙側大腦半球、腦干及雙側小腦半球內未見明確異常密度影。中線結構居中，無明顯移位；雙側側腦室對稱、稍擴大；腦溝腦裂稍增寬。顱骨未見異常征象。CT診斷為腦萎縮。MMSE得分20/30分（定向能力8/10分，語言功能6/8分，計算力2/5分，詞語即刻回憶2/3分，延遲回憶2/3分，結構模仿0/1分），蒙特利爾認知評估評分20/30分（視空間與執(zhí)行能力4/5分，命名2/3分，注意4/6分，語言2/3分，抽象1/2分，延遲回憶4/5分，定向3/6分），確診為AD。

圖3 家系成員TTC3基因的測序結果Fig.3 Sequencing results of the family member TTC3 gene

2.2 基因檢測結果

將先證者Ⅱ3作為主患者與其父母作為對照，進行全外顯子測序（圖3）后發(fā)現：①先證者Ⅱ3在TTC3基因的第24個外顯子發(fā)生c.2146C＞T突變，導致所編碼的TTC3蛋白的第716個氨基酸由原來的脯氨酸變?yōu)榻z氨酸（p.Pro716Ser），該突變來源于自發(fā)變異。②先證者Ⅱ3在TTC3基因的第9個外顯子發(fā)生c.758A＞G突變，導致所編碼的TTC3蛋白的第253位氨基酸由原來的酪氨酸變?yōu)榘腚装彼幔╬.Tyr253Cys），該突變來源于母親。

將以上測序后的突變位點分別對家系中成員（Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅱ7、Ⅱ8、Ⅱ9、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6）進行檢測后發(fā)現：（1）TTC3（c.2146C＞T）突變組檢測結果均無變異。（2）TTC3（c.758A＞G）突變組僅在家系成員（Ⅱ2、Ⅱ7、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅲ4）檢測出有雜合變異。

結果說明TTC3（c.2146C＞T）突變組與EOFAD發(fā)病無明顯相關性，而TTC3（c.758A＞G）突變組在EOFAD發(fā)病可能存在一定相關，因其中Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅲ4三個家庭成員年齡太?。ǎ?歲），未達到該家系中患病年齡平均水平（35歲左右），但家系中有一例目前臨床癥狀表現正常的成員（Ⅱ7）也存在有該位點突變，考慮其可能暫未發(fā)病，該基因突變基本符合家系共分離，呈常染色體顯性遺傳。

2.3 生物信息預測結果

利用PolyPhen-2對TTC3突變型蛋白進行有害性預測（圖4），TTC3基因c.758A＞G錯義突變在PolyPhen-2軟件上的預測是有害的，有害性評分是0.998（評分越接近1越有可能有害），且該突變點在人、小鼠、老鼠、狗、黑猩猩和長臂猿等物種中氨基酸序列分析顯示高度保守。圖5是該突變在各物種保守性分析預測結果。同樣由SIFT軟件預測結果顯示，突變后的評分-3.902分（評分越低于-2.5分越有可能有害），認為該突變會影響表型（圖6）。

圖4 PolyPhen-2軟件預測TTC3基因的突變對表型的影響Fig.4 PolyPhen-2 software predicts the effect of mutations in the TTC3 gene on phenotype

圖6 SIFT軟件預測突變對表型效應的影響Fig.6 SIFT software predicts the effect of mutations on phenotypic effects

3 討論

圖5 TTC3基因突變在各物種中保守性分析預測Fig.5 Conservative analysis and prediction of TTC3 gene mutation in various species

我們通過全外顯子測序技術發(fā)現先證者在TTC3基因存在復合雜合突變：c.758A＞G（p.Tyr253Cys）的錯義突變，并且通過Sanger測序驗證。c.758A＞G（p.Tyr253Cys）為第9個外顯子的編碼區(qū)第758位堿基A突變?yōu)镚，導致所編碼的TTC3蛋白的第253位氨基酸由原來的酪氨酸變?yōu)榘腚装彼幔╬.Tyr253Cys），并且該點錯義突變在家系中其他成員中滿足家系共分離，且在生物信息學預測上為有害性，但此突變對蛋白復合物功能的實際影響需要進一步的動物實驗及蛋白功能測定以證實。根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會聯合美國分子病理學學會（ACMG-AMP）的序列變異分級標準指南，滿足PM1+PP（1-5），屬于可能致病性變異。

阿爾茨海默病是一種最常見的進行性神經系統退行性疾病，主要表現為認知功能。日常生活能力下降及精神行為異常等。以65歲為界，可以分為早發(fā)型阿爾茨海默病及晚發(fā)型阿爾茨海默病。其中約62%的早發(fā)型阿爾茨海默病有家族史，大部分以常染色體顯性方式遺傳。隨著分子遺傳學技術的進展，AD的遺傳學研究取得了一定的進展。到目前為止，有數十種基因與AD發(fā)病相關。其中，EOFAD家系研究相關的基因主要與APP、PS1、PS2三個基因有關，其中最常見的為PS1突變引起。關于AD的基因突變分析多來自于國外，國內研究相對較少。

在本家系中，我們在先證者與其母親和兄妹同患者中發(fā)現了TTC3基因的第9個外顯子的第758位核苷酸序列發(fā)生A→G突變，該位置的氨基酸由原來的酪氨酸變成半胱氨酸，可能是導致早發(fā)性家族性阿爾茨海默病的發(fā)病，并且發(fā)病的家系成員的臨床癥狀進展較快，且發(fā)病年齡較早（＜30歲），首發(fā)癥狀為記憶力減退，反應遲鈍，言語不流利，其中大部分患者最終均表現出典型的阿爾茨海默病的相關癥狀，如空間及時間定向力，計算、判斷、語音能力減退，性格改變等，疾病進展較快，晚期智力和認知功能如同幼兒。其中有一名家系成員（Ⅱ7）也攜帶此突變基因，但未出現有相應的阿爾茨海默病的癥狀及影像學的改變，考慮到其家系中女性成員普遍發(fā)病年齡較男性晚，我們繼續(xù)保持隨訪。此外，我們還發(fā)現有3名家系成員（第Ⅲ代）攜帶此突變，由于年齡較小（＜15歲）以及目前尚無AD的相關表現，可能為癥狀前患者，我們將繼續(xù)隨訪觀察，以進一步證實基因檢查的結果，同時也可以早預防、早治療。

在過去研究當中，并未有報道過TTC3基因的調控作用與AD發(fā)病相關。對于TTC3基因的研究僅僅在唐氏綜合征中，TTC3基因主要在21號染色體中唐氏綜合征關鍵區(qū)域（DSCR）中，該基因是唐氏綜合征候選基因之一［8］。TTC3蛋白是由2025個氨基酸組成的蛋白質，并且含有由富含半胱氨酸和組氨酸殘基的短基序組成的典型H2-環(huán)指狀結構域［9］。TTC3基因參與神經元增殖和分化，TTC3過表達能夠對神經突觸延伸起到強烈的抑制作用［10］；TTC3表達分布主要位于神經元細胞中［11］。唐氏綜合征（Down's syndrome，DS）病人常常表現出腦發(fā)育不正常，智力低下，年輕時發(fā)生阿爾茨海默病的發(fā)病率高［12］。DS中的腦形態(tài)特征在于皮質大小減小，小腦不成比例地變小，膽堿能神經元丟失［12］。神經元細胞系的功能研究表明TTC3在泛素化，Akt信號傳導途徑，負性細胞周期控制和神經元分化抑制中發(fā)揮重要作用［13-16］。因此，TTC3可能在多種AD發(fā)病相關途徑中起作用。此外，這些過程在正常神經元和突觸功能以及Aβ和tau蛋白病理學方面相互交織。同時TTC3蛋白是一種E3泛素連接酶，作為細胞存活的核心細胞內途徑Akt信號傳導的特異性末端調節(jié)劑［17］。Akt/mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶標）信號傳導是主要的細胞衰老途徑，并涉及多種與年齡相關的人類疾病［18］。此外，大量證據表明Akt/mTOR信號作為關鍵因素參與在AD疾病中失調的神經元途徑，損害TTC3蛋白功能的遺傳變異可通過降低TTC3抵消活化的Akt的能力來促成AD易感性，從而促進Akt/mTOR 活性的增加［19］，這可能與早發(fā)型AD的發(fā)病機制相關。

在先前報道的研究當中APP、PS1、PS2三個基因的突變是引起EOFAD的最常見的重要遺傳致病因素，對此TTC3基因的突變在EOFAD發(fā)病當中所起的調控作用是一個新的發(fā)現，同時有可能作為一種新候選基因參與早發(fā)性家族性阿爾茨海默病的調控。此發(fā)現豐富了阿爾茨海默病家系資料庫，同時為探討早發(fā)型家族性阿爾茨海默病的發(fā)病機制提供了重要依據。