卵巢刺激和卵母細(xì)胞體外成熟在女性腫瘤患者生育力保存中的應(yīng)用

郭映純，李婷婷，朱婉珊，方 叢

（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510655）

全國(guó)腫瘤登記中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示［1-3］，2013年中國(guó)女性惡性腫瘤的發(fā)病率約246/10萬(wàn)，宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌的發(fā)病率持續(xù)位列前十。其中育齡女性（15～49歲）的發(fā)病率逐年上升。隨著惡性腫瘤早期診出率的提高、腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展以及可生育年齡的不斷增長(zhǎng)，越來(lái)越多的癌癥患者在治愈后有生育力保存的需求。然而對(duì)于這部分患者來(lái)說(shuō)，現(xiàn)代的抗癌癥治療在明顯降低腫瘤死亡率的同時(shí)，也帶來(lái)了生育力下降等副作用。美國(guó)腫瘤臨床學(xué)會(huì)發(fā)表的生育力保存指南建議，醫(yī)生應(yīng)盡早為腫瘤患者提供生育力保存的咨詢渠道，與患者討論關(guān)于疾病本身或治療對(duì)育齡患者生育力的影響，告知患者生育力保存的措施。而其中，胚胎或卵子冷凍應(yīng)作為女性生育力保存的常規(guī)措施［4］。卵子冷凍或胚胎冷凍技術(shù)要求首先獲得成熟的卵子，根據(jù)患者的婚姻狀況及患者的意愿選擇冷凍卵子或胚胎。目前常見(jiàn)的獲卵方案有兩大類，一類為應(yīng)用促排卵藥物進(jìn)行促排；另一類為直接緊急取患者的未成熟卵子進(jìn)行卵母細(xì)胞體外成熟操作。但目前尚存在促排卵藥物可能刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或推遲腫瘤治療時(shí)機(jī)的顧慮，此外，不同促排卵方案或直接取卵后行卵母細(xì)胞體外成熟的臨床效果尚不明確。本文旨在通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析本中心已進(jìn)行的為女性腫瘤患者冷凍卵子或胚胎的病例，初步探討不同獲卵方式的特點(diǎn)以及臨床效果，為后續(xù)個(gè)性化制定女性腫瘤患者生育力保存方案提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究回顧性分析2014年7月至2018年5月期間在中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因生育力保存需求行胚胎或卵子冷凍的患者資料。經(jīng)倫理委員會(huì)審批，根據(jù)患者具體情況制定獲卵方案，并簽署相關(guān)知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為：存在取卵手術(shù)禁忌證，不能耐受相關(guān)手術(shù)。進(jìn)一步根據(jù)獲卵方式不同將患者資料分為微刺激/拮抗劑組、黃體期促排卵組、黃體酮方案組以及緊急取卵組。

1.2 促排卵方案

根據(jù)患者自身情況、就診日所處月經(jīng)周期及可供促排卵時(shí)間個(gè)體化制定促排卵方案。原則上應(yīng)盡量減少藥物劑量，縮短治療時(shí)間。其中乳腺癌患者可自促排卵日開始，每日口服來(lái)曲唑（芙瑞，江西恒瑞醫(yī)藥）5 mg至取卵后10 d。

對(duì)于距離后續(xù)腫瘤治療時(shí)間約2周，預(yù)測(cè)促排卵反應(yīng)良好的患者，可供選擇的方案如下。于卵泡期就診患者，可選擇微刺激或拮抗劑方案，即在月經(jīng)第2日至第3日開始使用促性腺激素（Gonal-F，Serono，瑞士）啟動(dòng)。或者選擇黃體酮方案進(jìn)行促排，即于月經(jīng)周期第2日至第5日起每日口服安宮黃體酮（浙江仙琚制藥，中國(guó)浙江）10 mg或黃體酮軟膠囊（Utrogestan?，安琪坦，Besins-Iscovesco公司，法國(guó)）0.2 g至誘發(fā)排卵日。同時(shí)肌肉注射促性腺激素，5至8天后復(fù)診，再根據(jù)卵巢反應(yīng)情況調(diào)整劑量直至誘發(fā)排卵日。對(duì)于黃體期就診患者，則采用黃體期促排卵方案（Luteal phase stimulation，LPS），即在排卵后開始使用促性腺激素啟動(dòng)。以上方案于出現(xiàn)3個(gè)17 mm以上優(yōu)勢(shì)卵泡或主導(dǎo)卵泡直徑＞18 mm以上時(shí)使用重組人絨促性素α（艾澤，Merck Serono）250 μg誘發(fā)排卵。在扳機(jī)后36～38 h行超聲引導(dǎo)下取卵，再根據(jù)患者婚姻狀況及個(gè)人需求選擇冷凍卵子或行受精后冷凍胚胎。行冷凍卵子患者，于取卵后2至3小時(shí)拆除顆粒細(xì)胞觀察卵子情況，采用玻璃化冷凍方式冷凍MII期成熟卵子。行冷凍胚胎患者，于誘發(fā)排卵后39～40 h行常規(guī)體外受精（in vitro fertilization，IVF），若有活力的精子密度小于1×106/mL，則行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI），后置于培養(yǎng)箱（體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，37℃恒溫）中培養(yǎng)16～18 h，觀察受精情況。觀察到受精正常的胚胎放入G1培養(yǎng)液（Vitrolife，Sweden）中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3天或第5～6天，采用玻璃化冷凍方式冷凍分別進(jìn)行卵裂期和囊胚期胚胎冷凍。

1.3 卵母細(xì)胞體外成熟

對(duì)于不適合應(yīng)用促排卵藥物，或腫瘤治療時(shí)間緊迫的患者，可選擇直接行取卵手術(shù)，部分患者于卵巢獲取手術(shù)后同時(shí)體外取卵，以上方式可在患者月經(jīng)周期任意時(shí)間施行，且所需時(shí)間短，但所獲得卵為未成熟卵，卵泡直徑不定，需行卵母細(xì)胞體外成熟操作。即用吸針將卵泡中的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物釋放出來(lái)，置于含卵母細(xì)胞體外成熟液的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行序貫培養(yǎng)，至30 h觀察卵母細(xì)胞的成熟情況，將成熟卵母細(xì)胞行ICSI或冷凍保存。未成熟的卵母細(xì)胞在原培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至42 h，成熟的卵母細(xì)胞行ICSI或冷凍保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料以百分比（n/N）表示。對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)于不滿足方差分析基本條件的，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析；對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，對(duì)于不滿足卡方檢驗(yàn)條件者，進(jìn)行連續(xù)性校正或采用Fisher確切概率法。以上均行雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究共納入27例生育力保存患者冷凍卵子或胚胎的數(shù)據(jù)，表1列舉了患者的原發(fā)疾病及治療情況。根據(jù)促排卵方案的不同，再將患者分為微刺激/拮抗劑組（10例）、黃體期促排卵組（6例）、黃體酮方案組（3例）以及緊急取卵組（8例）。

從表2中我們可以看到，接受生育力保存的患者預(yù)期的卵巢儲(chǔ)備大多較好，可適用于各種促排卵方案。

從促排卵的實(shí)際情況來(lái)看（表3），緊急取卵患者所用時(shí)間最短，為2.6 d。而應(yīng)用促排卵藥物的周期，時(shí)間也都控制在2周內(nèi)，為大部分腫瘤患者可提供的時(shí)間限度。數(shù)據(jù)顯示，黃體期促排方案使用時(shí)間較長(zhǎng)，原因可能在于其中1例患者在卵泡期就診，但已有的卵泡數(shù)過(guò)少，選擇了在已有卵泡排出后行黃體期促排，而對(duì)于黃體期就診的患者，應(yīng)用黃體期促排卵所用時(shí)間則明顯減少，仍是可取的。本研究所用的Gn總用量平均約為910 U，乳腺癌患者在hCG日的雌激素水平平均為360 pg/mL，比非腫瘤患者低。

表1 生育力保存患者原發(fā)疾病Table 1 Primary disease of fertility preservation patients

由表4可見(jiàn)，各獲卵方式均獲得明顯成效。促排卵周期的卵子成熟率較高，可供冷凍或受精的卵子數(shù)目也相應(yīng)較多。對(duì)于有條件行卵子受精及胚胎冷凍的患者，各組的胚胎質(zhì)量也與非腫瘤患者無(wú)明顯差異。但因樣本量較小，仍無(wú)法得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)論。由于腫瘤治療及觀察時(shí)間的限制，目前尚無(wú)胚胎移植及妊娠病例。

3 討論

3.1 腫瘤患者應(yīng)用促排卵藥物的安全性問(wèn)題

在條件許可的情況下，獲取更多的卵子將為腫瘤患者帶來(lái)更多的希望。然而，激素的應(yīng)用存在刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)，特別是發(fā)病率居首位的乳腺癌以及生殖系統(tǒng)的腫瘤。早在2002年，一項(xiàng)納入近16萬(wàn)名女性的Meta分析指出［5］，長(zhǎng)期低濃度的雌激素暴露是乳腺癌的危險(xiǎn)因素。此外，通過(guò)對(duì)接受促排卵治療與自然受孕的孕婦產(chǎn)后30年的隨訪比較［6］，學(xué)者發(fā)現(xiàn)前者的子宮相關(guān)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)升高（RR值為1.47）。但以上風(fēng)險(xiǎn)值的升高并不能排除不孕患者腫瘤背景風(fēng)險(xiǎn)的干擾［7］，即不論是否接受助孕治療，不孕患者自身的腫瘤發(fā)生率，特別是卵巢癌的發(fā)生率是比普通人群高的。助孕治療對(duì)女性患者腫瘤發(fā)生的影響尚不明確。且在實(shí)際情況下，助孕治療一般包括手術(shù)治療、促排卵藥物等綜合治療，手術(shù)治療以及后續(xù)的成功妊娠都可能干擾促排卵藥物對(duì)腫瘤發(fā)生影響的判斷。即使是盡量平衡干擾因素，不同促排卵藥物對(duì)腫瘤發(fā)生的影響也不能一概而論。在一項(xiàng)大樣本隊(duì)列研究中［8］，研究者隨訪了應(yīng)用不同促排卵藥物患者30年的乳腺癌發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)促性腺激素的應(yīng)用與否及累計(jì)時(shí)間與乳腺癌的發(fā)生率沒(méi)有明顯的相關(guān)性，而對(duì)于應(yīng)用克羅米芬患者，首次應(yīng)用時(shí)年齡超過(guò)35歲（HR值為1.31）、累計(jì)用量超過(guò)2 251 mg以及使用周期數(shù)超過(guò)6個(gè)周期（HR值為1.31）可能提高乳腺癌的發(fā)生率。在目前的臨床應(yīng)用中，如上所述的累計(jì)用量及周期數(shù)較為少見(jiàn)?？偟膩?lái)說(shuō)，應(yīng)用促排卵藥物是否增加不孕患者腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)尚無(wú)明確的結(jié)論，而對(duì)于已診斷腫瘤的患者，暫無(wú)相關(guān)的大樣本數(shù)據(jù)及長(zhǎng)期隨訪比較的數(shù)據(jù)發(fā)布。

表2 生育力保存患者基本情況Table 2 Patient demographics of fertility preservation patients

表3 不同獲卵周期特點(diǎn)Table 3 Oocytes retrieval cycle characteristics

表4 生育力保存卵子及胚胎質(zhì)量Table 4 Oocyte yield and embryo development

3.2 腫瘤患者促排卵的特點(diǎn)

本研究27例病例中，24例為患者接受化療或?qū)β殉补δ苡袚p傷的手術(shù)之前，3例為應(yīng)用免疫抑制劑或化療藥物后。大部分患者卵巢反應(yīng)性普遍較好，卵子及胚胎質(zhì)量無(wú)明顯下降。其中已接受6次化療治療的患者出現(xiàn)卵巢功能衰退表現(xiàn)，對(duì)促排卵藥物的反應(yīng)性也較差。關(guān)于放療對(duì)卵子毒性的研究也表明［9］，2 Gy劑量的放療可導(dǎo)致約50%的卵泡丟失。目前有生育力需求的女性腫瘤患者大多年紀(jì)較輕，腫瘤科醫(yī)師應(yīng)盡早為患者提供生育力保存咨詢的途徑，盡量在施行對(duì)卵巢功能有損傷的治療前讓患者對(duì)治療的影響充分了解，自主選擇是否進(jìn)行生育力保存［10］。

在本研究中，乳腺癌患者促排卵過(guò)程中均聯(lián)合應(yīng)用來(lái)曲唑治療，可較好地控制患者促排卵期間體內(nèi)的雌激素水平。另一項(xiàng)相似的研究［11］納入215名乳腺癌患者，實(shí)驗(yàn)組聯(lián)合應(yīng)用促性腺激素及來(lái)曲唑促排卵凍存卵子及胚胎，空白組不施行生育力保存，通過(guò)比較兩組在平均23～33個(gè)月的乳腺癌復(fù)發(fā)率初步探究促排卵藥物應(yīng)用于乳腺癌患者的安全性。結(jié)果表明兩組間的乳腺癌復(fù)發(fā)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在該研究中，乳腺癌患者在促排卵過(guò)程中雌激素高峰為（405.94±256.64）pg/mL，與本研究的研究結(jié)果相似。結(jié)合多項(xiàng)研究的Meta分析也得出相同的結(jié)論［12］，該分析還指出，應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）扳機(jī)可更快地降低雌激素水平，相比較于應(yīng)用hCG扳機(jī)，對(duì)患雌激素敏感腫瘤的患者更有利。也有研究認(rèn)為［13］，GnRHa扳機(jī)可提高腫瘤患者的獲卵率。在本研究中，由于樣本量較少，尚未對(duì)GnRHa及hCG扳機(jī)進(jìn)行比較，待后續(xù)更大樣本進(jìn)行系統(tǒng)研究。

為盡量縮短患者接受后續(xù)腫瘤治療的等待時(shí)間，對(duì)于月經(jīng)周期黃體期就診的患者，建議應(yīng)用黃體期促排卵方案進(jìn)行促排。自黃體期促排卵方案應(yīng)用以來(lái)，其對(duì)各層次卵巢反應(yīng)的病人均有較好的效果。在本研究中，黃體期促排卵的患者卵子質(zhì)量及胚胎質(zhì)量與其他組別無(wú)明顯差異。類似研究也表明［14］，對(duì)于腫瘤患者，在卵泡期及黃體期均能有效地獲卵。

對(duì)于時(shí)間緊迫或不適合接受促排治療的患者，卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成為重要的生育力保存手段，即在排除手術(shù)禁忌證后行緊急取卵手術(shù)或在卵巢切除術(shù)后抽取未成熟卵泡。部分卵巢腫瘤患者已通過(guò)上述方法保存生育力并在2014年獲得第一例活產(chǎn)［15］。這種方法對(duì)于不適用促排卵藥物的青春期前患者尤為重要。由于化療對(duì)青春期前患者卵巢功能的影響小于成人，即使在化療后行卵巢組織冷凍及卵母細(xì)胞體外成熟也是可行的。已有實(shí)驗(yàn)室比較化療前及化療后青春期前患者的卵泡體外成熟效果［16］，兩組取卵后卵泡閉鎖率（29.6%vs 37%）及卵母細(xì)胞體外成熟率（32%vs 26.4%）無(wú)明顯差異。雖然緊急取卵的卵母細(xì)胞體外成熟率較低，但對(duì)于腫瘤患者而言，考慮腫瘤治療時(shí)機(jī)及促排卵適應(yīng)癥局限性，這種獲卵方式仍是可取的［17］，有待后續(xù)進(jìn)一步改進(jìn)體外培養(yǎng)系統(tǒng)以提高成熟率，為特殊的患者提供更多的可能。

綜上所述，在臨床應(yīng)用中，我們應(yīng)根據(jù)患者的年齡、卵巢儲(chǔ)備情況、原發(fā)腫瘤疾病特點(diǎn)、就診時(shí)機(jī)等個(gè)性化選擇獲卵方案，并不斷優(yōu)化改善臨床及實(shí)驗(yàn)室方案，以期為更多腫瘤患者提供妊娠機(jī)會(huì)。