局部應(yīng)用上皮鈉通道阻滯劑對干眼兔淚液分泌的影響

魏 園，陳曉敏，陳冬翠，周世有

（中山大學(xué)中山眼科中心//眼科學(xué)國家重點實驗室，廣東廣州 510060）

淚液的量、質(zhì)或流體動力學(xué)的異常會引起淚膜不穩(wěn)定和（/或）眼表損害，主要表現(xiàn)為眼部干澀、灼燒痛、眼紅、異物感、眼癢、視力下降等，臨床上稱為“干眼癥”［1］。嚴(yán)重干眼者會導(dǎo)致視力下降明顯，甚至導(dǎo)致失明，給正常的工作和生活帶來困擾［2-3］。近年來，隨著視頻終端的普及、人口老齡化、空氣污染等原因，干眼癥的發(fā)病率越來越高?，F(xiàn)有流行病學(xué)研究顯示：我國的干眼癥發(fā)病率高達(dá)21%～30%，全球有超過10億人口存在不同程度的干眼癥。臨床上最常見的干眼癥為水樣液缺乏型［4］。在淚膜穩(wěn)態(tài)的維持和失衡過程中，淚液變化機(jī)制的研究始終占據(jù)著淚液疾病研究的核心位置。近年來，通過體外電生理實驗發(fā)現(xiàn)：結(jié)膜上皮和其他組織上皮一樣，存在著多種離子通道，結(jié)膜分泌的液體量占到了淚液總量的25%左右［5］。水分的轉(zhuǎn)運依賴于離子的轉(zhuǎn)運，當(dāng)離子轉(zhuǎn)運調(diào)控失衡，則會出現(xiàn)一系列癥狀，典型代表如囊性纖維?。?］。鈉離子是最常見的陽離子之一，鈉離子的轉(zhuǎn)運伴隨著水分的移動。在與上皮細(xì)胞基底膜上的 Na+/K+-ATPase 的共同作用下［7-10］，上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）介導(dǎo)了Na+的跨上皮轉(zhuǎn)運，帶動水分的轉(zhuǎn)運完成上皮吸收功能。但結(jié)膜ENaC在干眼癥的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機(jī)制到目前尚不清楚，本研究旨在探討ENaC通道與淚液分泌變化的關(guān)系，探討能否可以將其作為干眼癥治療的分子靶向目標(biāo)，為干眼癥的治療提供一種新選擇。

1 材料與方法

1.1 試劑和動物

正常雄性新西蘭白兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購于廣州花都區(qū)華東信華實驗動物養(yǎng)殖場（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2014-0023），動物飼養(yǎng)及實驗操作均在中山大學(xué)中山眼科中心實驗動物中心普通區(qū)進(jìn)行（實驗單位使用許可證編號：SCXK（粵）2015-0058），并遵守中山大學(xué)中山眼科中心動物實驗倫理規(guī)定以及“眼科和視覺研究動物使用”的ARVO申明，飼養(yǎng)環(huán)境采用12 h光照-黑暗循環(huán)，室溫20～25℃，動物可自由取食和取水。

阿米洛利（Amiloride）、東莨菪堿（scopolamine hydrochloride，SCOP）購于 Sigma-Aldrich公司，細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（MTT BB-4201貝博生物），胰酶細(xì)胞消化液購于Invitrogen公司，熒光定量PCR試劑購自南京諾唯贊公司。

1.2 組織的制備

經(jīng)兔耳緣靜脈注射速眠新（0.3 mL/kg），1 min后取下結(jié)膜上皮組織，放入BRS（Bicarbonate Ringer’s Solution）溶液中適當(dāng)潤洗，而后鉗夾在短路電流灌流小室的中間，兩側(cè)的灌流小室各加入5 mL BRS溶液（NaCl 116.4，KCl 5.4，CaCl21.8，NaHCO325，MgSO40.81，NaH2PO40.78 mmol/L）。

1.3 短路電流

使用北京泰盟科技公司的短路電流裝置［11-13］。將放大器連接BL420+生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，BL420+生物機(jī)能系統(tǒng)輸出連接電腦。實驗時設(shè)置參數(shù)為：采樣率10 Hz，掃描速度40s/格子數(shù)，增益2，時間常數(shù)DC，濾波0.3 Hz。

將結(jié)膜上皮組織固定在面積為0.5 cm2的灌流小室中，向小室管兩側(cè)各加入5 mL相應(yīng)的BRS溶液，通入混合氣體（體積分?jǐn)?shù)95%O2和5%CO2），當(dāng)表示電流的圖形曲線達(dá)到平穩(wěn)時，往頂膜面（A面，apcial side）加藥，觀察電流的變化，待電流達(dá)到最大變化值時，測量加藥前后的電流差值（ΔIsc），計算單位面積的短路電流變化量，即短路電流=ΔIsc/0.5/放大倍數(shù)（μA/cm2）。

1.4 熒光定量PCR

用Trizol提取總RNA，根據(jù)諾唯贊公司熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行產(chǎn)物合成［14］。所用的PCR儀為Thermo Fisher PikoReal 96。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，PCR：95 ℃ 10、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，溶解曲線：95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃15 s?；谀康幕蚝涂醇一?qū)崟r熒光定量擴(kuò)增曲線得到 Ct（C 為 Cycle，t為 threshold）值，用Folds=2-ΔΔCt表示實驗組目的基因與對照組目的基因表達(dá)量的倍比關(guān)系。實驗重復(fù)例數(shù)為3。引物序列如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers sequence of real time PCR

1.5 干眼模型的制作

實驗組皮下注射0.8 mL東莨菪堿（5 mg/mL），對照組注射等量生理鹽水（溶劑），各一天4次。分別于給藥第0、3、6、9、12天觀察眼表，檢測淚液分泌量以及角膜熒光素鈉染色拍照記錄，待淚液下降至5 mm以下以及出現(xiàn)角膜熒光素鈉染色陽性，造模完成［15-17］。

1.6 淚液的測量和熒光素鈉染色

淚液分泌量采用Schirmer實驗，即：將淚液檢測濾紙條一端反折5 mm，置于下眼瞼外側(cè)1/3處結(jié)膜囊內(nèi)，5 min后取出，讀取淚液浸入的長度。每次測量重復(fù)3次，取均值為最終測量值。分別在實驗前和實驗第3、6、9、12天按照如上方法行淚液分泌情況的檢測并記錄。

1.7 局部應(yīng)用上皮鈉通道抑制劑阿米洛利

阿米洛利粉劑溶于生理鹽水中，配成100 mmol/L滴眼劑，8只干眼模型制作完成后，右眼用阿米洛利滴眼，作為治療組別，左眼滴用溶劑生理鹽水，作為自身對照，分別于第3、6、9、12天進(jìn)行熒光素鈉染色和淚液分泌檢測。

1.8 MTT實驗

用0.25%胰蛋白酶消化并收集新西蘭兔結(jié)膜上皮細(xì)胞，并計數(shù)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液［18-21］。以2.0×104/mL、100 μL/孔接種于96孔板上，加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將上皮鈉通道抑制劑阿米洛利儲存溶液倍比稀釋為工作液終濃度分別為 10×104、10×103、1000、100、10、1 μmol/L，對照組不加，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，于24 h取出96孔板，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清；每孔加入150 μL DMSO與無水乙醇的混合液（體積比1∶1）震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶標(biāo)儀上，以波長570 nm測定各孔光密度（Optical density，OD）值；以測定孔OD-空白孔OD表示每組的實際OD值；以正常對照組的細(xì)胞活力為100%，各實驗組的細(xì)胞活力=實驗組OD的實際值/對照組OD的實際值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0、GraphPad prism5進(jìn)行處理分析。數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組之間比較采用單樣本t檢驗。多組間的比較采用one-way ANOVA（方差齊時）或Welch法（方差不齊時），兩兩比較采用Tukey′s multiple comparison test。不同時間的淚液測量采用重復(fù)測量方差分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 東莨菪堿誘導(dǎo)的干眼模型的病理現(xiàn)象

2.1.1 淚液分泌檢測結(jié)果 實驗組和對照組淚液分泌的比較如表2，由此可看出造模組注射SCOP第3天淚液分泌量明顯下降，隨時間延長，淚液分泌量進(jìn)行性遞減，在第12天降至5 mm以下，為（4.42±1.34）mm，與對照組相比淚液分泌量顯著下降（t=13.363，P＜0.001，n=8）。

2.1.2 角膜熒光素鈉染色 在第3、6、9、12天進(jìn)行熒光素鈉染色，實驗中觀察到模型組兔角膜第6天開始出現(xiàn)點狀熒光素鈉染色，第12天出現(xiàn)片狀染色，對照組熒光素鈉染色陰性（圖1）。

2.2 兔結(jié)膜上皮在不同狀態(tài)下的鈉電流變化

三組間方差分析，F(xiàn)=72.41，P＜0.001，n=8/groups。短路電流結(jié)果見圖2。對照組中兔子結(jié)膜上皮鈉電流大小為（5.72±0.35）μA/cm2（n=8），實驗組鈉電流升高至（12.24± 0.54）μA/cm2（n=8），兩組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。治療組經(jīng)過上皮鈉通道特異性阻滯劑阿米洛利（100 mmol/L）連續(xù)點眼12 d、每天3次后，同未經(jīng)過治療的實驗組相比，其鈉電流大小明顯降低，降至（4.00±0.61）μA/cm2，與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3，P≥0.05）。

表2 東莨菪堿對淚液分泌的影響Table 2 The effect of scopolamine on tear secretion ［（n=8 pairs，X ± S，mm/5 min）］

圖1 兔角膜熒光素鈉染色照相Fig.1 Fluorescein sodium staining of rabbit’s cornea

圖2 上皮鈉通道介導(dǎo)的鈉電流Fig.2 Sodium current mediated by epithelial sodium channel

圖3 上皮鈉通道介導(dǎo)的鈉電流統(tǒng)計學(xué)結(jié)果Fig.3 Statistical results of sodium currents mediated by epithelial sodium channels

2.3 兔結(jié)膜上皮鈉通道基因在干眼癥治療前后的變化

取下對照組、實驗組、治療組的結(jié)膜上皮，通過熒光定量PCR方法檢測上皮鈉通道ENaCα、ENaCγ以及炎癥因子IL-1β，結(jié)果顯示，實驗組中ENaCα、ENaCγ以及炎癥因子IL-1β表達(dá)升高，并且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。治療組經(jīng)過阿米洛利點眼后，ENaCα、ENaCγ以及炎癥因子IL-1β表達(dá)下降，與對照組組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

2.4 局部滴用上皮鈉通道阻滯劑后眼表的變化

圖5 阿米洛利點眼后淚液分泌浸入長度的變化趨勢Fig.5 The variation trend of tear’s quantity after amiloride application in dry eye model rabbit

治療前，右眼淚液分泌量為（4.42±1.30）mm，左眼淚液分泌量為（6.25± 1.10）mm（圖5），左右眼熒光素鈉染色皆為片狀染色（圖6）。治療第3天，右眼淚液分泌增加至（16.67±0.67）mm，具有統(tǒng)計學(xué)差異（F=36.64，P＜0.001，n=8），熒光素鈉染色顯示上皮缺損減輕，第6天淚液分泌浸入長度達(dá)到頂峰并維持一段時間，上皮染色范圍局限在第一象限，隨著給藥時間延長，淚液分泌趨于正常，上皮染色逐漸減輕，治療第12天右眼淚液為（14.25± 0.54）mm（n=8，F(xiàn)=36.64，P=0.000）。左眼未給予治療，作為自身對照。左眼第3、6、9、12天淚液分別為（6.00±1.06、7.60±0.92、9.30±2.04、5.50± 0.99）mm（與治療前相比，P皆＞0.05，n=8；多組間比較，F(xiàn)=0.002，P=0.965）。

圖7 MTT檢測細(xì)胞存活率柱狀圖Fig.7 Histogram of cell survival by MTT

2.5 MTT法檢測阿米洛利對兔結(jié)膜上皮細(xì)胞體外增殖的影響

圖6 干眼癥模型兔用阿米洛利點眼后角膜上皮的變化Fig.6 Changes of corneal epithelium after amiloride eye drops for the rabbits in tested group

阿米洛利對兔結(jié)膜上皮細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，不能抑制細(xì)胞增殖（圖7，F(xiàn)=2.365，P＞0.05，n=6）。

3 討論

目前傳統(tǒng)治療干眼癥的方法主要是滴人工淚來維持眼表濕潤，或者通過刺激淚腺分泌緩解干眼癥狀［22］。

最近有文獻(xiàn)報道P2Y2受體激動劑，地瓜磷酸可以促進(jìn)淚液分泌，改善干眼癥狀，促黏蛋白分泌的藥物如DE-089和15-S-HETE也可以改善干眼癥［23］。因為結(jié)膜上皮是一層“分泌型”上皮［24］，我們提出使用局部阿米洛利滴眼液的想法，希望通過抑制結(jié)膜上皮鈉通道來增加眼表淚量。我們認(rèn)為，這種抑制會導(dǎo)致眼表上皮對“現(xiàn)存的眼表淚液”的吸收受到抑制，從而增加淚液向眼表的分泌。在驗證這一假說之前，我們進(jìn)行了短路電流實驗，以證實上皮鈉通道在兔結(jié)膜組織中的存在。

本研究中，我們應(yīng)用上皮鈉通道特異性阻滯劑作用于兔結(jié)膜上皮面觀察離子轉(zhuǎn)運，確定了ENaC存在于結(jié)膜上皮頂膜面，接著我們通過對兔皮下連續(xù)注射東莨宕堿12 d，建立淚液分泌不足型干眼模型，根據(jù)臨床檢測指標(biāo)淚液分泌量和角膜熒光素鈉染色來確定干眼模型的可靠性。下一步，我們對兔進(jìn)行局部阿米洛利滴眼液滴眼，觀察淚液量隨時間的變化?？紤]到眼表的自身修復(fù)作用，我們采取了自身對照的方法，即讓右眼接受阿米洛利的治療，左眼僅僅滴用等量溶劑生理鹽水，結(jié)果，在治療的第3天，右眼淚液逐漸增多，并且持續(xù)升高，到第6天達(dá)到高峰，左眼淚液分泌量無明顯變化。我們注意到，盡管接受阿米洛利滴眼液的眼睛的眼表淚液分泌量隨后繼續(xù)增加，眼表染色減輕直至恢復(fù)至完整狀態(tài)，對側(cè)的鹽水滴眼液的淚量無明顯改變，但是眼表染色減輕，可能是由于左右眼之間存在神經(jīng)反饋作用所致。

本研究發(fā)現(xiàn)，東莨菪堿誘導(dǎo)的干眼癥組鈉電流增大，即鈉離子過度被吸收，這個現(xiàn)象最先在囊性纖維化病患者呼吸道黏膜上皮中發(fā)現(xiàn)，Huang等［25］在異源表達(dá)系統(tǒng)中證明了CFTR（囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子）對上皮鈉通道的抑制作用，解釋了該現(xiàn)象。但是右眼經(jīng)過阿米洛利連續(xù)12 d的治療，鈉離子通道的開放逐漸減少并恢復(fù)至正常。接下來，我們檢測了正常對照組，干眼癥模型組，以及治療組的ENaC，IL-1β基因表達(dá)變化，結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)干眼癥組的ENaC亞基以及炎癥因子IL-1β基因表達(dá)升高，經(jīng)過12 d的治療后，治療組與正常組之間，ENaC亞基以及炎癥因子IL-1β基因表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，我們通過體外實驗，MTT顯色法檢測阿米洛利對兔結(jié)膜上皮增殖的影響，該藥物對結(jié)膜上皮細(xì)胞無明顯抑制作用。通過在體實驗，兔子接受阿米洛利局部點眼過程中，眼表無充血紅腫，無分泌物。

本研究不足之處在于未對結(jié)膜上皮鈉離子的整個轉(zhuǎn)運信號通路做出研究，接下來的研究將著重探討鈉離子的轉(zhuǎn)運以及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步解釋干眼癥中鈉離子通道的病理生理改變。

綜上所述，我們提出并且驗證：結(jié)膜上皮鈉離子過度吸收是干眼癥發(fā)病機(jī)制之一，并針對該靶點，通過關(guān)閉該通道來治療干眼癥，淚液分泌增加，促進(jìn)角膜上皮修復(fù)，改善干眼癥狀，有望成為治療干眼癥中新的選擇。