長鏈非編碼RNA HULC沉默表達對人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞SHG44增殖和凋亡的影響

李 倩，尹恬恬，胡宇辰，吳 景，張 敏，何 杰，

（1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院//中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院，安徽合肥230031；2.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院西區(qū)//安徽省腫瘤醫(yī)院，安徽合肥230031）

膠質(zhì)瘤是大腦中最常見的原發(fā)性腫瘤，而膠質(zhì)母細胞瘤是其惡性度最高的組織學類型。膠質(zhì)母細胞瘤細胞自身較強的增殖能力和侵襲性是其成功治療的主要障礙。目前臨床采用手術、放療、化療和生物治療等綜合治療手段，但患者生存期改善不明顯，預后仍很差，中位生存期14月左右［1］。目前研究認為，尋求特異性針對膠質(zhì)母細胞瘤增殖和侵襲機制的治療方案，將有可能遏制腫瘤的生長。近年相關研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在多種腫瘤中存在顯著的表達改變，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲轉移、自噬及化療敏感性等生物學行為的調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生進展中發(fā)揮重要作用［2］，有可能成為在膠質(zhì)母細胞瘤侵襲、預后的分子標記物，將為臨床腫瘤的靶向治療提供依據(jù)。肝癌高表達轉錄本（highly up-reglated in 1iver cancer，HULC）是LncRNA的一種，被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)［3-4］，但在膠質(zhì)母細胞瘤中表達狀況的報道甚少。本研究為了證實HULC在膠質(zhì)母細胞瘤細胞中的表達及對膠質(zhì)母細胞瘤生長的影響，以沉默表達HULC的膠質(zhì)母細胞瘤細胞株SHG44為研究對象，采用CCK8、平板克隆、細胞周期及細胞凋亡等實驗探討LncRNA HULC沉默表達對膠質(zhì)母細胞瘤細胞株SHG44增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞株SHG44（中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國），胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，美國），NC、HULC-siRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司，中國），細胞增殖毒性檢測試劑盒（合肥新恩源生物技術有限公司，中國），吉姆薩染液（合肥新恩源生物技術有限公司，中國），Annexin V-488凋亡試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國），總RNA提取試劑盒（QIAGEN，德國），cDNA逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃，50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期SHG44細胞，通過針對基因HULC的慢病毒干擾載體構建、慢病毒包裝、病毒侵染、致死濃度及穩(wěn)篩株構建，獲得穩(wěn)定轉染的實驗組細胞株，即轉染HULC抑制劑的SHG44細胞為HULC干擾組（HULC-siRNA），轉染HULC抑制劑空白載體SHG44細胞為HULC干擾組的陰性對照組（NC），將實驗組細胞置于37℃，50 mL/L CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后傳代收集對數(shù)生長期細胞進行相應檢測。

1.2.2 qRT-PCR實驗 消化收集細胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，然后按照cDNA逆轉錄試劑盒說明書制備cDNA反應程序：42℃30 min；85℃10 min。再運行qRT-PCR反應程序：95℃，變性3 min，40個擴增循環(huán)（95℃12 s，62 ℃ 40 s）。 HULC 引 物 上 游 序 列 ：5′-TCAACCTCCAGAACTGTGATCC-3′，下游序列：5′-TGCTTGATGCTTTGGTCTGTT-3′。以 ACTB 為內(nèi)參，ACTB引物上游序列：5′-CGTGGACATCCG CAAAGA-3′，下 游 序 列 ：5′-GAAGGTGGACAG CGAGGC-3’。以 2-ΔΔCt計算 HULC mRNA 的相對表達量。實驗重復三次，并用GraghPad Prism 5軟件分析結果。

1.2.3 CCK8增殖實驗 消化收集對數(shù)生長期的各組細胞，離心重懸后計數(shù)，調(diào)整濃度約2.0×104細胞/mL；準備4塊96孔板，向每孔加入100 μL細胞懸液（每孔含2 000個細胞），每組細胞設6個復孔；在細胞樣本孔周圍一圈每孔加入200 μL PBS溶液，置于37℃，50 mL/L CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日，待細胞貼壁后取出第一塊96孔板，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 100 mL/L CCK8液（將CCK8母液用完全培養(yǎng)基做10倍稀釋使用），置培養(yǎng)箱中孵育2 h后上酶標儀檢測450 nm處的吸光度值（OD值），此為24 h OD值，其余各板每孔補加完全培養(yǎng)基 100 μL，并依次在 48 h、72 h 和96 h以同樣的方法檢測相應的OD值。實驗重復三次，并用GraghPad Prism 5制作各組細胞上述四個時間點的生長曲線。

1.2.4 平板克隆形成實驗 消化收集對數(shù)生長期的各組細胞，離心重懸后計數(shù)，以每孔300個細胞接種6孔板，每組細胞設3個復孔；每3～5 d換液，約10～12 d終止培養(yǎng)，40 mL/L多聚甲醛溶液固定30 min，吉姆薩染液染色8 min，清水洗去染液后晾干，顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕剩?）＝克隆數(shù)/實際接種細胞數(shù)×100%。實驗重復3次，并用GraghPad Prism 5軟件分析結果。

1.2.5 細胞周期實驗 消化收集對數(shù)生長期的各組細胞，用預冷的PBS漂洗2次，加入500 μL PBS重懸后緩慢加入到5 mL 700 mL/L預冷乙醇中，于4℃固定過夜；次日取出固定后的細胞，以1000 r/min（r=6 cm）的速度離心3 min，棄去上清，用PBS輕柔漂洗1次，并用500 μL PBS重懸細胞，然后加入 10 μL RNase A（10 mg/mL），輕柔混勻后置于37℃溫箱孵育30 min，取出細胞并加入5 μL PI（100 μg/mL）染液，室溫避光孵育15 min，立即進行流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。實驗重復3次，并用FlowJo 7.6.1和GraphPad Prism 5軟件分析結果。

1.2.6 細胞凋亡實驗 用不含EDTA的胰酶消化、離心收集各組細胞，調(diào)整細胞終濃度為1×106/mL，預冷PBS漂洗2次，向細胞中加入100 μL鈣離子緩沖液輕柔吹打混勻制成單細胞懸液，先后加入5 μL Annexin V-488染液和5 μL PI染液，注意設置Annexin V-488和PI單染組和無染液的空白對照組，輕柔混勻，室溫避光孵育15 min，再加入500 μL鈣離子緩沖液重懸細胞，輕柔混勻后立即進行流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率。實驗重復3次，用FlowJo 7.6.1和GraghPad Prism 5軟件分析結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，兩組均數(shù)比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗，P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HULC沉默表達效果鑒定

將HULC抑制劑（HULC-siRNA組）及抑制劑空白載體（NC組）轉染SHG44細胞后，采用qRTPCR檢測HULC的表達，與NC組相比，轉染HULC-siRNA組的HULC表達水平顯著減少（圖1），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.616，P=0.003），說明實驗組細胞建立成功。

圖1 SHG44細胞的HULC沉默表達穩(wěn)轉細胞系表達水平驗證Fig.1 Verification of expression levels of HULC-silenced stably transfected cell lines in SHG44 cells

2.2 沉默表達HULC抑制SHG44增殖、促進其凋亡

CCK8增殖實驗顯示實驗第2、3、4天HULC-siRNA組細胞OD450值明顯低于NC組（圖2A）；平板克隆形成實驗顯示NC組和HULC-siRNA組的克隆形成率分別為（34.11±1.24）%和（14.44±0.87）%，沉默表達HULC細胞克隆形成率顯著降低（圖2B）；細胞周期實驗顯示NC組和HULC-siRNA組的細胞數(shù)分別為：G1期（36.89±4.09、51.74 ± 0.68），S期（46.95 ± 2.49、36.89 ± 2.13），沉默表達HULC細胞周期被阻滯G1/S期（圖2C）；細胞凋亡實驗顯示NC組和HULC-siRNA組的早期凋亡率分別為（2.57±0.22）%和（7.06±0.71）%，沉默表達HULC細胞早期凋亡率顯著增加（圖2D）。上述實驗差異均具有統(tǒng)計學意義（圖2A：第2天：t=6.616，P=0.003，第3天：t=19.93，P=0.005，第4天：t=31.41，P=0.009；圖2B：t=13.01，P＜0.001；圖 2C：G1期 t=3.577，P=0.023，S期 t=3.063，P=0.038；圖2D：t=6.045，P=0.004），說明HULC 沉默表達后可抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、阻滯細胞周期進展并促進其凋亡。

3 討論

LncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼調(diào)控RNA，主要通過與其他分子（如蛋白質(zhì)，DNA，RNA和金屬離子）相互作用以形成適當?shù)娜壗Y構來發(fā)揮生物學功能。LncRNA影響各種生物學過程的基本分子機制，包括染色質(zhì)組織、表觀遺傳調(diào)控、基因轉錄和翻譯、RNA轉換和基因組防御等［5-7］。目前很多LncRNA被證實在多種腫瘤中存在顯著的表達改變，并參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲轉移、自噬及化療敏感性等惡性生物學行為的調(diào)節(jié)。LncRNA HULC位于人類基因組6p24.3，于2007年通過芯片篩查在肝癌中發(fā)現(xiàn)并命名［3］。但隨后被大量文獻陸續(xù)報道在胃癌、結直腸癌、胰腺癌、骨肉瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）等腫瘤中均有特異性高表達。文獻指出，HULC不僅在上述腫瘤的組織和細胞系中表達水平升高，而且與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、患者預后及生存期等都呈顯著正相關［3-4，8-11］。如Jin等［12］發(fā)現(xiàn)HULC在胃癌血清中的過表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期和幽門螺桿菌感染有關。Peng等［8］使用qRT-PCR發(fā)現(xiàn)HULC在DLBCL組織和細胞系中均顯著過表達，且與DLBCL的Ann Arbor分期、B癥狀（發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量減輕）、CHOP方案治療、利妥昔單抗治療和國際預后指數(shù)（IPI）等密切相關。同時，有學者還指出，HULC的敲低可抑制腫瘤細胞的致瘤性［11］。如Uzan等［10］研究發(fā)現(xiàn)HULC在骨肉瘤（OS）組織和細胞系中與正常對照相比顯著上調(diào)，他們通過用小干擾RNA抑制HULC的表達進行功能實驗，顯示細胞的增殖、遷移和侵襲能力都明顯受抑制。但HULC在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達情況目前報道甚少，我們課題組前期實驗通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織中HULC的表達水平明顯高于瘤旁組織，膠質(zhì)母細胞瘤細胞中HULC高表達，并應用膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87進行細胞功能實驗得出HULC過表達促進細胞增殖、遷移和侵襲能力的結論［11］。本實驗通過向膠質(zhì)母細胞瘤細胞SHG44中轉染HULC抑制劑并以qRT-PCR驗證其表達被沉默，行功能實驗發(fā)現(xiàn)SHG44細胞的生長和增殖受到抑制，顯示HULC扮演著促癌基因的角色，促進癌細胞的增殖、侵襲和轉移，抑制癌細胞凋亡。

眾所周知，腫瘤是一種多基因疾病，其特征在于細胞生長的不受控制、細胞周期的失調(diào)以及對細胞凋亡的抵抗性。腫瘤細胞的命運取決于某些關鍵分子的表達，包括腫瘤抑制因子，致癌基因以及細胞周期調(diào)節(jié)因子等。HULC作為促癌基因已在多種類型腫瘤中得到證實，對于其機制的研究在多種類型腫瘤中也具有多樣性。如在鼻咽癌中有學者發(fā)現(xiàn)沉默HULC表達后癌細胞周期被阻滯在G1期并促進細胞凋亡［13］，機制是HULC的敲低觸發(fā)了p53的活化并誘導了p21的基因表達，p53和p21的表達被激活后引發(fā)了鼻咽癌細胞的細胞周期停滯和細胞凋亡，指出沉默HULC表達后可通過激活p53-p21途徑顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖能力。Li等［14］等研究發(fā)現(xiàn)HULC和YB-1的亞細胞共定位，YB-1是被認為是一種癌蛋白，調(diào)節(jié)多種增殖途徑，超越細胞周期檢查點，并促進基因組不穩(wěn)定性、血管生成和轉移。所以他們指出HULC在肝癌中的促癌機制是與YB-1蛋白特異性結合并通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）加速其磷酸化，導致YB-1從YB1-mRNA復合物中釋放并促進沉默mRNA的翻譯包括細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E1和基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）。此外，他們的研究還顯示HULC可抑制順鉑誘導的細胞凋亡。目前在HULC對膠質(zhì)母細胞瘤方面的機制研究也有報道，有學者認為HULC通過調(diào)節(jié)作為Skp-1/2靶標的細胞周期蛋白A/D1/E、p-Rb、c-Myc、CDK2/4和p16/p21/27的表達來誘導腫瘤增殖、遷移和細胞周期進展，以及通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax和caspase-3/8的表達來誘導腫瘤失巢凋亡抵抗抑制細胞凋亡［15］。本實驗發(fā)現(xiàn)沉默表達HULC后SHG44的G1期明顯延長，阻斷了有絲分裂中的細胞，表明HULC通過促進G1/S轉換增強細胞增殖，另外沉默表達HULC后SHG44細胞早期凋亡率升高，表明HULC促進細胞凋亡。我們認為HULC可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路阻斷細胞周期G1/S期并誘導失巢凋亡，從而影響膠質(zhì)母細胞瘤細胞生物學行為，有待下一步機制實驗驗證。

圖2 不同處理組SHG44細胞的增殖、周期分布及凋亡情況Fig.2 Proliferation，cycle distribution and apoptosis of SHG44 cells in different treatment groups

綜上所述，本實驗對HULC的初步了解提示HULC在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中起著重要的作用，可能是會作為腫瘤的治療靶點和預后標志物，為廣大臨床腫瘤患者的診治帶來福音，但目前研究尚淺。后期我們將進一步進行體內(nèi)、體外研究，探討HULC對膠質(zhì)瘤生物學行為的調(diào)控機制，為膠質(zhì)母細胞瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。