應(yīng)用雙靶標(biāo)CRISPR慢病毒載體在間充質(zhì)干細(xì)胞中穩(wěn)定敲除lncRNADANCR基因

彭 丹，鐘小敏

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究中心，廣東廣州510080）

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類堿基長(zhǎng)度大于200 nt且不具備蛋白編碼功能的RNA，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老、腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。LncRNA DANCR最初被報(bào)導(dǎo)在細(xì)胞分化過程中表達(dá)降低，且對(duì)維持細(xì)胞的未分化狀態(tài)是不可缺少的［1］。隨著對(duì) DANCR（anti-differentiation noncoding RNA）功能研究的深入發(fā)現(xiàn)，DANCR也影響著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，如參與腫瘤干細(xì)胞的維持、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移等［2］。近來有研究發(fā)現(xiàn)DANCR在間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）的成骨、成脂和成軟骨的三向分化過程中也起到重要作用［3］，DANCR的表達(dá)能促進(jìn)MSC的成軟骨分化而抑制其成骨分化［4-5］，影響骨再生與軟骨再生過程。CRISPR/Cas9［clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated 9（Cas9）］技術(shù)作為第三代基因編輯技術(shù)，與前兩代基因編輯技術(shù)鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger endonuclease，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）相比，能對(duì)基因進(jìn)行精準(zhǔn)的編輯，且操作更為簡(jiǎn)便有效，近年來廣泛應(yīng)用于各種基因突變細(xì)胞株和基因突變動(dòng)物的構(gòu)建。lncRNA因不具備蛋白編碼潛能，而以RNA分子的形式行使生物學(xué)功能，同時(shí)大部分lncRNA的活性作用位點(diǎn)尚未被研究清楚，所以可以預(yù)見，lncRNA分子上單一堿基的突變不一定能影響lncRNA整體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，即應(yīng)用CRISPR方法靶向單一位點(diǎn)難以阻斷l(xiāng)ncRNA功能。而常規(guī)的CRISPR/Cas9技術(shù)在進(jìn)行兩位點(diǎn)同時(shí)突變和小片段缺失時(shí)效率較低，常需要較大的工作量才能獲得純合克隆。本研究旨在通過雙靶標(biāo)CRISPR慢病毒載體，同時(shí)靶向于DANCR的5’及3’端，對(duì)DANCR進(jìn)行全基因片段敲除，并構(gòu)建慢病毒敲除載體，穩(wěn)定敲除MSC中的DANCR基因。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及菌株

人胚腎上皮293FT細(xì)胞（購自Invitrogen公司）、骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)建系）及大腸桿菌菌株DH5α（購于天根生化科技有限公司）。

1.2 質(zhì)粒及主要試劑

pX330A-1X2載體和pX330S-2載體（購于Addgene公司）、V6載體（由Professor Chunliang Li，St.Jude Children′s Research Hospital贈(zèng)予）、慢病毒包裝質(zhì)粒pMDG、pRSV和pMDLg/pRRE（購于Addgene公司）；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（購于天根生化科技有限公司）；限制性核酸內(nèi)切酶 BbsⅠ、KpnI和 EcoRI、T7 Endonuclease I（T7E1）及T4連接酶（購于New England BioLabs公司）；Infusion kit（購自Takara公司）；RNA提取試劑TRI-Reagent（購于MRC公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購于賽默飛世爾科技公司）；熒光定量PCR試劑SYBR（購于Roche公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

293FT細(xì)胞的培養(yǎng)：使用DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)），含10%胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）及雙抗（100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素）（Hyclone，美國(guó)），置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；MSC的培養(yǎng)：使用DMEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)），含10%胎牛血清，及雙抗（100 U/mL青霉素和 0.1 mg/mL鏈霉素），置于37℃，含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 單一sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

使用張鋒實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的在線設(shè)計(jì)sgRNA網(wǎng)站（http：//tools.genome-engineering.org），設(shè)計(jì)靶向DANCR的sgRNA［6］，挑選得分較高的兩條靶向于5’端和兩條靶向于 3’端的 sgRNA，5’端 1#：ACGCACAGCCAATCCCGGAT，5’端 2#：CTGGTT TGTGCGCCCGTCGC，3’端 1#：GTTAATTGACTA ACAACCCC，3’端 2#：GCTTCTCCACCAGTCGGA GG，合成4對(duì)寡聚核苷酸序列。如表1。

本研究中的序列合成及測(cè)序均交由生工生物工程股份有限公司完成，用BbsⅠ切割pX330A-1X2載體和pX330S-2載體，電泳后行切膠回收。將4對(duì)sgRNA分別退火并磷酸化處理后，5’端sgRNA連入線性化的pX330A-1X2載體（Amp抗性），3’端sgRNA連入線性化的pX330S-2載體（Kana抗性），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，并使用相應(yīng)抗性的LB平板篩選陽性克隆。挑取單克隆搖菌并用U6 promoter引物測(cè)序，測(cè)序正確的菌液轉(zhuǎn)移至5 mL含相應(yīng)抗性的液體LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，取0.5 mL菌液與0.5 mL已滅菌的體積分?jǐn)?shù)為30%甘油混合保存菌種，剩余菌液使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

表1 DANCR sgRNA寡核苷酸序列Table 1 Sequence of DANCR sgRNA oligonucleotide

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及sgRNA靶向性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前一天接種至6孔板中，于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37℃培養(yǎng)箱于孵育 24 h，轉(zhuǎn)染時(shí)將 2 μg 質(zhì)粒加至 200 μL Opti-MEM中混勻，靜置5 min后加入6 μL Megatran1.0，輕輕混勻并室溫孵育15 min，均勻滴加至6孔板的一個(gè)孔中。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后72 h使用基因組提取試劑盒進(jìn)行基因組提取。根據(jù)sgRNA靶向位點(diǎn)設(shè)計(jì)靶向效率檢測(cè)引物，DANCR 5’端檢測(cè)引物-F：CAAGAGCACC AAAATCACCAACG ；DANCR 5’端檢測(cè)引物-R：CGCAAAATTGTTACGGTGCCCAG ；DANCR 3’端檢測(cè)引物-F：TGACCCTTACCCTGAATACTCTG CA ；DANCR 3’端檢測(cè)引物-R：CACCAGGACAC CAAATCTCAAGAG。以轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行普通PCR，得到的PCR產(chǎn)物跑膠，并使用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行膠回收，取500 ng膠回收產(chǎn)物退火雜交，用T7E1進(jìn)行酶切，酶切后電泳檢測(cè)酶切條帶。使用Image J軟件分析各條帶灰度值，根據(jù)公式 %Indels=［1-×100%計(jì)算打靶效率（其中a和b表示發(fā)生基因突變的DNA序列被切割后獲得的短片段灰度值，c表示未發(fā)生基因突變而未被切割的長(zhǎng)片段灰度值）。

1.6 將雙靶標(biāo)sgRNA連接至同一慢病毒載體

使用Golden gate assembly試劑盒將3’sgRNA連接至 5’sgRNA/pX330A-1x2載體：取 75 ng 5’sgRNA/pX330A-1x2與150 ng 3’sgRNA/pX330S-2混合，加入1 μL Golden mix和1 μL buffer，加雙蒸水調(diào)整體積至20 μL，放入PCR儀，37 ℃ 5 min，16℃5 min，循環(huán)30次，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，使用Amp抗性的LB平板篩選陽性克隆，挑取克隆送至公司用測(cè)序引物1測(cè)序：CGGGCCATTTACCGT AAGTTATGTAACG。得到正確質(zhì)粒后，設(shè)計(jì)引物將sgRNA及相關(guān)元件通過Infusion試劑盒克隆至V6載體（Amp抗性），PCR-F：GGTTAATTAAGGT ACCGCTGGCCTTTTGCTCACATGTG；PCR-R：CCT AGCTAGCGAATTCGTTATGTAACGGGTACCTCTA GGCC。以連入兩條sgRNA序列的pX330A-1×2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，用內(nèi)切酶KpnI和EcoRI分別對(duì)PCR膠回產(chǎn)物和V6載體進(jìn)行雙酶切，酶切后電泳行切膠回收。取50 ng膠回收產(chǎn)物與100 ng線性化的V6載體，加入2 μL infusion 5 × mix，用水補(bǔ)齊體積至10 μL，50℃孵育1 h后取2 μL連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使用Amp抗性的LB平板篩選陽性克隆，挑取克隆送至公司用PCR-F測(cè)序。得到正確質(zhì)粒后保存相應(yīng)菌種并提取質(zhì)粒用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.7 慢病毒包裝及感染MSC

將慢病毒包裝質(zhì)粒：pMDG、pRSV和pMDLg/pRRE，按1∶1∶2比例混勻并調(diào)整濃度為1 μg/μL，取15.42 μL與8.58 μg構(gòu)建好的雙sgRNA/V6質(zhì)?；旌希又?00 μL Opti-MEM中，室溫靜置5 min，然后加入72 μL轉(zhuǎn)染試劑Megatran 1.0混勻，室溫靜置15 min，加入到T75中的293FT細(xì)胞（轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度控制在80%～90%，轉(zhuǎn)染前半換液），培養(yǎng)12 h后換液，分別收集換液后48 h和72 h的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，上清900×g，4℃，離心15 min，用0.45 μm濾器過濾去除細(xì)胞碎片，取濾液50 000×g高速離心90 min沉淀病毒，去除上清后用1 mL無血清培養(yǎng)基重懸病毒沉淀，分裝病毒保存于-80℃。MSC在感染病毒前一天鋪板，感染時(shí)細(xì)胞密度為20%～30%，并加入polybrene使其終濃度為8 μg/mL，感染12 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 鑒定MSC中DANCR敲除效率

使用基因組提取試劑盒提取MSC基因組DNA，取等量基因組DNA作為模板，使用DANCR 5‘端檢測(cè)引物-F和DANCR 3’端檢測(cè)引物-R進(jìn)行PCR，跑膠觀察條帶大小。使用Image J軟件分析各條帶灰度值，利用公式 %Indels=［1-×100%計(jì)算敲除效率（其中a表示被敲除后的小片段灰度值，b表示未發(fā)生敲除的野生型片段灰度值）。將條帶進(jìn)行切膠回收，直接將膠回收產(chǎn)物用PCR-F進(jìn)行測(cè)序，并與DANCR基因參考序列進(jìn)行比對(duì)。

1.9 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MSC中DANCRmRNA表達(dá)水平

RNA提取前將細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%，移除培養(yǎng)基并用分別加入1 mL預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞，移除PBS后每孔加入1 mL TRI-Reagent裂解細(xì)胞，室溫靜置10 min后將細(xì)胞吹落，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。每管加入200 μL三氯甲烷并顛倒6～8次充分混勻，于冰上靜置3 min，此時(shí)可見液體分層，11 000×g，4℃，離心15 min，離心結(jié)束后液體分為三層，其中上層透明液體中含RNA。小心吸取400 μL上層透明液體至不含RNA酶的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇并顛倒6～8次充分混勻，于冰上靜置10 min后，11 000×g，4℃，離心15 min。離心后可在管底見到白色RNA沉淀，棄上清，每管加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇漂洗沉淀，11 000×g，4℃，離心5 min后棄上清，晾干RNA沉淀至邊緣透明，視沉淀多少加入20～30 μL不含RNA酶的去離子水溶解沉淀。測(cè)定濃度，取1 μg RNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA后按1∶1稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，DANCR-F：GCCACTATGTAGCGGGTTTC；DANCR-R：GCCT GTAGTTGTCA ACCTGC，熒光定量PCR每孔體系為：cDNA 1 μL、SYBR 5 μL、引物 2 μL、水2 μL，總體系10 μL，熒光定量PCR儀檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，P值顯著性水準(zhǔn)均為0.05（雙側(cè)檢定），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單一sgRNA載體構(gòu)建及打靶效率

利用麻省理工學(xué)院張鋒實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的在線sgRNA工具設(shè)計(jì)網(wǎng)站，靶向DANCR的5’和3’端各設(shè)計(jì)兩條sgRNA，并分別命名為sgRNA5’-1、sgRNA5’-2 和 sgRNA3’-1、sgRNA3’-2。 各sgRNA的靶向序列在DANCR基因中的位置如圖1A所示。通過退火使寡核苷酸單鏈形成雙鏈，然后將退火產(chǎn)物分別連入pX330A-1X2載體和pX330S-2載體，使用U6 promoter引物測(cè)序，測(cè)序正確質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果如圖1B-1E所示。擴(kuò)增正確質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293FT，提取293FT基因組DNA，經(jīng)T7E1酶切后檢測(cè)打靶效率，結(jié)果如圖1F所示，sgRNA5’-1、sgRNA5’-2 和 sgRNA3’-1、sgRNA3’-2的打靶效率分別為6.62%、4.96%、5.60%、5.60%。

2.2 雙靶標(biāo)載體構(gòu)建

雙sgRNA載體構(gòu)建示意圖如圖2A所示，通過Golden gate assembly試劑盒將 sgRNA5’-1和sgRNA3’-1連至同一個(gè)載體、sgRNA5’-2和sgRNA3’-2連接至同一個(gè)載體，使用測(cè)序引物1進(jìn)行測(cè)序，擴(kuò)增測(cè)序正確的質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增雙sgRNA相關(guān)元件，并連接至慢病毒CRISPR載體V6，分別命名為1#DANCR KO/V6和2#DANCR KO/V6，菌液PCR鑒定陽性克隆，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并使用PCR-F進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖2B、2C所示。

2.3 檢測(cè)雙靶標(biāo)慢病毒載體在MSC中對(duì)DANCR的敲除效率

圖1 單一sgRNA載體構(gòu)建及打靶效率Fig.1 Single sgRNA vector construction and targeting efficiency

在293FT中進(jìn)行慢病毒包裝，V6載體帶有mcherry報(bào)告基因（如圖2A所示），故可通過觀察熒光強(qiáng)度判斷轉(zhuǎn)染效率。293FT熒光與明場(chǎng)合成圖如圖3A所示，收集病毒液并濃縮后感染MSC，感染后的MSC熒光與明場(chǎng)合成圖如圖3B所示，細(xì)胞感染陽性率較高，故未進(jìn)行流式分選。提取MSC總RNA檢測(cè)DANCR mRNA表達(dá)水平變化，1#載體敲除后MSC的DANCR表達(dá)水平下降至原來的（0.20±0.05）倍，2#載體敲除后MSC的DANCR表達(dá)水平下降至原來的（0.13±0.01）倍，結(jié)果如圖3C所示（樣本量為3；1#載體敲除后MSC的DANCR表達(dá)水平與對(duì)照組相比較，F(xiàn)=623.92，P=0.002；2#載體敲除后MSC的DANCR表達(dá)水平與對(duì)照組相比較，F(xiàn)=21053，P＜0.001）。提取MSC基因組DNA進(jìn)行DANCR敲除檢測(cè)，結(jié)果如圖3D所示。用Image J分析DANCR敲除效率，1#和2#載體的敲除效率分別為（58.4±11.0）%和（81.0±6.2）%，結(jié)果如圖3E所示（樣本量為3；1#載體敲除效率與對(duì)照組相比較，F(xiàn)=7 299.1，P＜0.001；2#載體敲除效率與對(duì)照組相比較，F(xiàn)=51 216，P＜0.001）。圖3D中敲除后的小片段PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化，將產(chǎn)物直接使用PCR-F引物進(jìn)行測(cè)序，并與DANCR基因參考序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示MSC DANCR KO 1#細(xì)胞DANCR缺失片段為1 743 bp，MSC DANCR KO 2#細(xì)胞DANCR缺失片段為1 601 bp，且缺失片段為5’sgRNA靶點(diǎn)與3’sgRNA靶點(diǎn)之間序列，比對(duì)結(jié)果如圖3F-3G所示。

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是基于細(xì)菌等原核生物利用CRISPR和Cas蛋白特異降解外源入侵核酸這一原理建立的基因編輯技術(shù)［7］。與TALEN和鋅指等基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單快速、成本低、效率高、作用位點(diǎn)更廣的優(yōu)點(diǎn)，自該技術(shù)建立以來便成為生命科學(xué)領(lǐng)域常用的研究工具，廣泛應(yīng)用于各種基因突變細(xì)胞株和基因突變動(dòng)物的構(gòu)建［8］。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類堿基長(zhǎng)度大于200 nt且不具備蛋白編碼功能的RNA，人類基因組中已有超過15 000個(gè)lncRNA被測(cè)序發(fā)現(xiàn)，且GENCODE中的注釋也在不斷更新。在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里lncRNA都被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的垃圾RNA，但近來的研究表明lncRNA在調(diào)節(jié)核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、疾病的發(fā)生等生理及病理過程。lncRNA-DANCR最初是在鈣離子誘導(dǎo)人初級(jí)角質(zhì)細(xì)胞分化的過程中被發(fā)現(xiàn)，通過RNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這一分化過程中DANCR的表達(dá)下調(diào)［1］。DANCR位于4q12染色體上，由三個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)度為915 bp。近年來的研究表明DANCR與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展有著密切聯(lián)系：通過與抑制CTNNB1的microRNA結(jié)合，解除microRNA對(duì)CTNNB1的抑制作用以增加肝癌細(xì)胞的干性，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展［9］；且DANCR受原癌基因MYC的調(diào)控，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞周期抑制因子P21的表達(dá)［10］；DANCR的表達(dá)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥性且與患者的不良預(yù)后相關(guān)［11］。相對(duì)于DANCR在腫瘤中的功能研究，DANCR在干細(xì)胞分化過程中的具體功能研究較少。已有研究表明下調(diào)牙髓干細(xì)胞中的DANCR表達(dá)促進(jìn)其成骨、成脂和神經(jīng)分化［12］，且DANCR參與MSC的三向分化過程，能促進(jìn)MSC的成軟骨分化［13-14］、抑制其成骨分化，而MSC經(jīng)歷骨祖細(xì)胞、前成骨細(xì)胞最終分化為成骨細(xì)胞的過程對(duì)骨折損傷和一些疾病后的骨再生過程有著重要意義［15］。

本研究通過分別靶向DANCR的5’和3’末端位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA，并將兩條sgRNA克隆進(jìn)同一慢病毒CRISPR載體，能達(dá)到較高的敲除效率。普通CRISPR技術(shù)常需要挑取較多克隆才能得到完全敲除的目的克隆，常帶來較大的工作量，并耗費(fèi)大量的培養(yǎng)基。我們構(gòu)建的雙靶標(biāo)慢病毒敲除載體能極大地提高敲除效率，分析原因：將兩條sgRNA連接在同一載體上，能保證兩套CRISPR系統(tǒng)能在同一細(xì)胞中表達(dá)，且通過慢病毒載體能整合至細(xì)胞的基因組中，保證敲除效率。已有的關(guān)于DANCR在MSC中的功能研究均使用干擾RNA敲低DANCR的表達(dá)，本研究首次構(gòu)建了DANCR敲除的MSC細(xì)胞系。穩(wěn)定敲除DANCR的MSC與使用干擾RNA敲低DANCR基因表達(dá)的MSC相比，干擾RNA只能降低DANCR的表達(dá)而無法完全清除，通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得DANCR基因敲除的MSC細(xì)胞株，完全缺失DANCR基因功能，有利于更深入、準(zhǔn)確的研究DANCR在MSC中的功能。DANCR敲除載體的構(gòu)建為進(jìn)一步深入研究DANCR在不同細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)，也可用于DANCR敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建。

綜上所述，本研究所應(yīng)用的雙靶標(biāo)sgRNA的CRISPR敲除慢病毒載體設(shè)計(jì)方案為長(zhǎng)片段的敲除提供了新的思路，可用于構(gòu)建其它lncRNA的CRISPR敲除載體。本研究建立的DANCR敲除的MSC細(xì)胞系，可用于深入研究DANCR在MSC中的功能。