LncRNA與凋亡相關(guān)基因在小鼠腸缺血再灌后腸黏膜表達(dá)譜中的變化及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

許 淼，楊 勇，鄧綺文，沈建通，劉衛(wèi)鋒，楊文靜，劉克玄

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510080；2.廣州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州510180；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州510515；4.鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，河南鄭州450052）

腸缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是圍術(shù)期常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，它常出現(xiàn)在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克、腸缺血性疾病，以及某些外科手術(shù)（如小腸移植術(shù)，肝移植術(shù)、腹主動(dòng)脈瘤手術(shù)及心肺轉(zhuǎn)流術(shù)等）中［1］。腸I/R不僅可引起腸道的局部損害，還可因腸損傷后腸內(nèi)細(xì)菌、內(nèi)毒素的移位導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)而導(dǎo)致腸外遠(yuǎn)隔器官損害、多器官功能不全甚至死亡［2］，其發(fā)病機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。研究表明凋亡是腸I/R后腸黏膜上皮細(xì)胞死亡的主要形式［3］，尋找調(diào)控腸I/R后腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)是防治腸I/R腸損傷的關(guān)鍵。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在眾多疾病的發(fā)生發(fā)展中，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡起到重要作用［4］。然而，lncRNA和腸I/R損傷關(guān)系的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道，其在腸I/R過(guò)程中是否發(fā)生了改變、是否在腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮作用亟待探討。

1 材料與方法

1.1 腸I/R損傷動(dòng)物模型

SPF級(jí)雄性C57Bl/6小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物體質(zhì)量范圍為19～20 g，許可證號(hào)：SYXK（粵）2010-0108。小鼠在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心集體飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB14925-2001）》規(guī)定。1%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg腹腔注射麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒，經(jīng)腹正中切口，分離腸系膜上動(dòng)脈（superiormesenteric artery，SMA），無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉，縫合切口。60 min后經(jīng)原切口進(jìn)腹，取出動(dòng)脈夾，恢復(fù)血供，于再灌注后2 h留取小腸黏膜標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和取材

12只雄性C57Bl/6小鼠隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組（sham operation group，S組）：僅行開(kāi)腹，分離SMA但不夾閉；腸缺血再灌注損傷組（I/R injury group，I/R組）：分離SMA，微動(dòng)脈夾夾閉之后縫合切口。60 min后經(jīng)原切口進(jìn)腹，松開(kāi)動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流進(jìn)行再灌注。

建立小鼠腸缺血再灌注損傷模型成功，于再灌注后2 h，在深麻醉下斷頸處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。距回腸末端5 cm處相同部位取一約1 cm腸段，除去外膜脂肪組織，置于40 g/L多聚甲醛溶液固定12 h，常規(guī)石臘切片，用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)。緊接其后取5 cm腸段，4℃PBS溶液沖洗后置于冰面上迅速刮取腸黏膜后液氮保存，用于lncRNA芯片篩選和驗(yàn)證，采用Array star小鼠lncRNA芯片V3.0（上?？党缮锛夹g(shù)有限公司）。

1.3 小腸組織光鏡觀察和病理學(xué)評(píng)分

小腸組織石蠟切片、HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察S組和I/R組小鼠小腸黏膜形態(tài)學(xué)變化，采用改良Chiu’s評(píng)分法［5］對(duì)腸黏膜損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分越高，表明損傷越嚴(yán)重（表1）。

1.4 基因芯片篩選腸黏膜中差異 lncRNA和mRNA

Arraystar小鼠LncRNAV3.0芯片可描述小鼠全局LncRNA和蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本譜，能夠檢測(cè)約35 923個(gè)LncRNA和24 881個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄本。

兩組樣品隨機(jī)選擇兩組各3個(gè)樣品，經(jīng)總RNA提取后，采用Agilent表達(dá)譜芯片配套的RNA擴(kuò)增及單標(biāo)試劑盒并按標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對(duì)總RNA進(jìn)行放大和標(biāo)記，并用RNeasy Mini Kit（Qiagen）純化標(biāo)記后的cRNA，并用NanoDrop ND-1000檢測(cè)濃度和活性；按照Agilent基因芯片試劑盒操作流程，使用Agilent surehyb進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。在滾動(dòng)雜交爐中65℃，10 r/min（r=10 cm），滾動(dòng)雜交 17 h，雜交 cRNA上樣量為1.65 μg，并在洗缸中洗片；完成雜交的芯片采用Agilent DNA Microarray Scanner芯片掃描，用Feature Extraction軟件V11.0.1.1讀取數(shù)據(jù)，用Gene Spring GX V12.1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過(guò)篩選高質(zhì)量探針（某探針在6個(gè)樣品中至少有3個(gè)被標(biāo)記為Present或Marginal）進(jìn)行進(jìn)一步分析。兩組樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)lncRNA或差異表達(dá)mRNA通過(guò)P-value/FDR篩選。兩個(gè)樣品間差異表達(dá)lncRNA或差異表達(dá)mRNA通過(guò)Fold Change篩選。

1.5 對(duì)差異mRNA的GO生物信息分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析，通過(guò)計(jì)算多個(gè)樣品兩兩之間的距離，構(gòu)成距離矩陣；隨后合并距離最近的兩類為一新類，計(jì)算新類與當(dāng)前各類的距離，再合并、計(jì)算，直至只有一類為止。用挑選的差異基因的表達(dá)情況來(lái)計(jì)算樣品直接的相關(guān)性，同一類樣品能通過(guò)聚類出現(xiàn)在同一個(gè)簇中，聚在同一個(gè)簇中的基因可能具有相似的生物學(xué)功能。

對(duì)篩選到的差異表達(dá)mRNA進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析，這是基因功能國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。通過(guò)GO分類號(hào)和GO數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)分析工具將類別與具體基因聯(lián)系起來(lái)，從而對(duì)這個(gè)基因的功能進(jìn)行描述。通過(guò)芯片的數(shù)據(jù)分析，可以發(fā)現(xiàn)哪些變化的基因共同屬于一個(gè)GO功能分支，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法測(cè)定該分類是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而得出這些變化基因各自可能參與的生物功能。

1.6 qRT-PCR驗(yàn)證上下調(diào)最明顯的差異lncRNA

采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)上/下調(diào)最明顯的6個(gè)差異長(zhǎng)鏈非編碼 RNA的引物（表 2），并由Invitrogen公司合成。按前述方法提取兩組各6個(gè)樣品的RNA，配制退火混合物，混合液在65℃水浴5 min，冰上放置2 min。12 000×g短暫離心后，在離心管中依次加入Reverse Transcriptase反應(yīng)液，混合后37℃恒溫1 min，50℃溫育60 min，70℃溫育15 min使酶失活，置冰浴待用或-20℃保存。將所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應(yīng)體系，12 000×g短暫離心。將8 μL混合液加到384-PCR板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，再加入對(duì)應(yīng)的2 μL cDNA，小心粘上Sealing Film封口膜，并短暫離心混合置于冰上，最后置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表1 腸粘膜損傷的改良Chiu’s評(píng)分Table 1 The modified Chiu score for intestinal mucosa injury

表2 挑選長(zhǎng)鏈非編碼RNA雙向引物序列表Table 2 Primers used for qRT-PCR

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。利用 2-ΔΔCT相對(duì)定量法分析，以管家基因GAPDH為內(nèi)參，以非處理組為校準(zhǔn)樣本檢測(cè)樣品中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄水平，每個(gè)樣品平行3次試驗(yàn)取均值進(jìn)行計(jì)算。

1.7 共表達(dá)CNC（coding-noncoding gene coexpression）網(wǎng)絡(luò)生物信息分析

1.7.1 結(jié)合GO、Pathway分析及文獻(xiàn)支持，比對(duì)芯片中差異腸I/R相關(guān)凋亡基因 根據(jù)第一部分芯片基因GO、Pathway分析的“凋亡”相關(guān)條目，同時(shí)參考大量腸I/R文獻(xiàn)報(bào)道的凋亡基因，挑選代表性的mRNAs，并比對(duì)在本芯片中它們的差異變化，觀察P值。

1.7.2 將上述凋亡mRNAs和所有差異lncRNA進(jìn)行CNC共表達(dá)分析 將lncRNA基因標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)，以及相同蛋白編碼基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本時(shí)，不同轉(zhuǎn)錄本的數(shù)據(jù)求均值作為作為基因的表達(dá)值。通過(guò)計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)上述凋亡mRNA和所有差異LncRNA之間的表達(dá)相關(guān)性（標(biāo)準(zhǔn)化后的信號(hào)強(qiáng)度）進(jìn)行分析，篩選Pearson相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值（pcc）≥0.995，F(xiàn)DR≤0.01，P＜0.05的共表達(dá)關(guān)系對(duì)。根據(jù)上述Pearson相關(guān)系數(shù)結(jié)果，利用Cytoscape工具繪制lncRNA和mRNA共表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；基因芯片部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用t檢驗(yàn)的P值和Fold Change倍數(shù)變化值進(jìn)行差異基因篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0，且P值＜0.05。共表達(dá)分析以Pearson相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值（pcc）≥0.995，F(xiàn)DR≤0.01，P＜0.05為條件篩選。

2 結(jié)果

2.1 小鼠小腸組織光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)及改良Chiu’s評(píng)分變化

圖1 小鼠小腸組織光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)成像圖（×200）Fig.1 Morphological imaging of mouse intestinal mucosa under optical microscope（×200）

再灌注2 h后，S組小鼠的腸黏膜組織完整，未見(jiàn)明顯出血及炎癥現(xiàn)象；I/R組小鼠的腸絨毛高度水腫，上皮細(xì)胞明顯脫落，腺體損傷嚴(yán)重，上皮下間隙擴(kuò)大并與固有層分離，固有層水腫、腸黏膜出現(xiàn)大片的出血和潰瘍，血管、淋巴管高度擴(kuò)張，損傷明顯（圖1）。與S組（0.37±0.18）比較，I/R組（3.56±0.45）小鼠的小腸組織改良Chiu’s評(píng)分升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.842，P=0.000，n=6/group，圖2），表明本研究中小鼠腸缺血60 min再灌注120 min后，發(fā)生了腸損傷，該模型制備成功。

2.2 基因芯片篩選獲得小鼠腸I/R損傷腸上皮中差異表達(dá)的lncRNA及mRNA

結(jié)果對(duì)檢出的原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析，與S組比較，腸I/R損傷后小鼠腸上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA及mRNA發(fā)生了明顯改變（P＜0.05），其上、下調(diào)前20位的lncRNA及mRNA聚類結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 小鼠腸粘膜形態(tài)學(xué)改良Chiu’s評(píng)分變化Fig.2 The Chiu’s score for mouse mucosal injury

總體上，I/R組篩選到差異表達(dá)的lncRNA共3 602個(gè)，其中差異表達(dá)上調(diào)的lncRNA有1 503個(gè)（Fold change≥2，P＜0.05）；差 異 表 達(dá) 下 調(diào) 的lncRNA 有 2 099個(gè)（Fold change≥2，P＜0.05）。并且在此結(jié)果中，差異倍數(shù)10倍以上升高的共11個(gè)（表3）；差異倍數(shù)10倍以上降低的共313個(gè)（Fold change≥10，P＜0.05）。

表3 差異表達(dá)10倍以上上調(diào)的lncRNA（I/R比Sham組）Table 3 Differentially expressed lncRNA(＞10.0 fold change,I/R vs Sham）（n=3/group）

表4 差異表達(dá)10倍以上上調(diào)的mRNA（I/R比Sham組）Table 4 Differentially expressed mRNA(＞10.0 fold change,I/R vs Sham) （n=3/group）

此外，基因芯片還篩選到差異表達(dá)的mRNA共3 158個(gè)，其中差異表達(dá)上調(diào)的mRNA有1 528（Fold change≥2，P＜0.05）；差異表達(dá)下調(diào)的mRNA有1 630個(gè)（Fold change≥2，P＜0.05）。10倍以上上調(diào)的有26個(gè)（表4），10倍以下下調(diào)的有410個(gè)（Fold change≥10，P＜0.05）。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，在上述上調(diào)的mRNA中，“Trpv6、Fos、Papss2、Trib1、Reg2、Reg1、Dusp5、Fosl2”可能跟凋亡相關(guān)［6-11］。

2.3 GO數(shù)據(jù)分析

2.3.1 GO分析差異表達(dá)的基因的生物學(xué)過(guò)程 基因芯片篩選小鼠腸I/R損傷中腸上皮差異基因分析如下：上調(diào)的mRNAs主要與脂代謝過(guò)程、氧化還原反應(yīng)、應(yīng)激、正性調(diào)控凋亡過(guò)程/程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期、線粒體凋亡改變、MAPK級(jí)聯(lián)、凋亡的誘導(dǎo)/執(zhí)行、炎性反應(yīng)、p53介導(dǎo)凋亡、鈣離子等有關(guān)。差異下調(diào)表達(dá)相關(guān)mRNA，主要與多細(xì)胞生物信號(hào)、神經(jīng)沖動(dòng)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、化學(xué)穩(wěn)態(tài)、分泌、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、Wnt受體信號(hào)通路、負(fù)向調(diào)控凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、組織重構(gòu)、VEGF受體信號(hào)通路等有關(guān)（圖4）。

2.3.2 GO分析中的“凋亡”相關(guān)條目 從本芯片GO分析的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)差異變化的基因富含了大量的“凋亡”相關(guān)功能條目（表5），共29條，其中包括：凋亡的外源性/內(nèi)源性階段，凋亡的誘導(dǎo)/執(zhí)行，凋亡的正性/負(fù)性調(diào)控，以及不同細(xì)胞定位和類型的凋亡調(diào)控等。

圖3 前20位的10倍以上差異表達(dá)的lncRNA和mRNA聚類圖（I/R比Sham組）Fig.3 The top 20 of hierarchical clustering about 10 fold change of lncRNA and mRNA expression profile（I/R vs Sham）

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證上/下調(diào)最明顯的差異lncRNA

在芯片中，隨機(jī)挑選了6個(gè)顯著差異表達(dá)的lncRNA，其中 3個(gè)上調(diào)（ENSMUST00000122117、AK089510、NR_002865），3個(gè)下調(diào)（uc007oua.1、ENSMUST00000129245、AK014219）。

經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組樣本表達(dá)水平相比，AK089510（t=8.499，P=0.011 8）、NR_002865（t=8.518，P=0.005 8）在I/R樣本內(nèi)的表達(dá)水平顯著升高，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而另外兩個(gè) ENSMUST00000129245（t=7.760，P=0.025 3）、AK014219（t=5.850，P=0.045 0）在I/R樣本內(nèi)的表達(dá)水平明顯降低（圖5）；其中AK089510上調(diào)的倍數(shù)最高，ENSMUST00000129245下調(diào)的倍數(shù)最高。qRT-PCR結(jié)果與基因芯片表現(xiàn)出較好的一致性。

2.5 將上述驗(yàn)證的lncRNA和所有差異mRNA進(jìn)行CNC共表達(dá)分析

2.5.1 結(jié)合go、pathway分析及文獻(xiàn)支持，挑選差異凋亡相關(guān)基因，在芯片結(jié)果中比對(duì)信息 通過(guò)在芯片GO、Pathway分析結(jié)果中上調(diào)的凋亡mRNA中進(jìn)行比對(duì)，挑選了與腸I/R文獻(xiàn)表達(dá)相符的10個(gè)mRNA，分別為：Stat3、Vdac1、Casp8、Fasl、Gadd45a、Casp6、Dusp6、Aifm1、Atf4、Bad（ 表6）［12-15］。

2.5.2 經(jīng)過(guò)CNC共表達(dá)生物信息學(xué)分析，將10個(gè)凋亡mRNA和存在高度相關(guān)性的 lncRNA構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 通過(guò)分析上述10個(gè)mRNA和芯片所有差異lncRNA的CNC共表達(dá)關(guān)系，尤其關(guān)注第一部分已行qPCR驗(yàn)證的4個(gè)lncRNA（AK089510、NR_002865、ENSMUST00000129245、AK014219），構(gòu)成了如下具有高度相關(guān)性的CNC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖6、表7）。

圖4 GO分析差異表達(dá)的基因的生物學(xué)過(guò)程Fig.4 Biological process of GO analysis for differentially expressed mRNAs

表5 凋亡相關(guān)GO分析條目Table 5 Apoptosis associated GO analysis items

CNC共表達(dá)結(jié)果示，上述凋亡mRNA和大量差異表達(dá)的lncRNA存在高度相關(guān)性，是一對(duì)多的關(guān)系。在此圖中共有726個(gè)結(jié)點(diǎn)，其中10個(gè)為上述mRNA，其余716個(gè)為lncRNA，它們共同組成了885對(duì)高度相關(guān)的共表達(dá)基因?qū)Α?/p>

紅色為芯片所有差異表達(dá)的lncRNA，綠色為經(jīng)qPCR驗(yàn)證的lncRNA，藍(lán)色node為挑選的差異凋亡mRNA。圖中實(shí)線表示兩個(gè)結(jié)點(diǎn)內(nèi)的基因之間存在正相關(guān)性，虛線則表示兩個(gè)兩個(gè)結(jié)點(diǎn)內(nèi)的基因之間存在負(fù)相關(guān)性，mRNA和lncRNA對(duì)的共表達(dá)程度用實(shí)線或虛線的長(zhǎng)度進(jìn)行表示。

3 討論

3.1 腸I/R后小鼠腸上皮細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜發(fā)生顯著變化

圖5 隨機(jī)挑選6個(gè)lncRNA的microarray和qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果比較Fig.5 Comparison of 6 randomly selected lncRNAs expression level between microarray and qRT-PCR validation

表6 挑選的10個(gè)凋亡mRNA在芯片結(jié)果中的比對(duì)信息Table 6 Ten apoptosis associated and differentially expressed mRNA in the microarray profiling（n=3/group）

表74 個(gè)驗(yàn)證的lncRNA與上述凋亡相關(guān)mRNA的共表達(dá)分析Table 7 The co-expression analysis of 4 validated lncRNA and the above apoptosis associated mRNA

近年來(lái)，曾被誤認(rèn)為基因轉(zhuǎn)錄“暗物質(zhì)”的長(zhǎng)鏈非編碼RNA成為研究的熱點(diǎn)。在人類基因組中，和大約只有1%比例的具有蛋白編碼功能的RNA相比，占絕大部分比例的lncRNA雖然沒(méi)有或很少具有蛋白質(zhì)編碼功能，但卻被發(fā)現(xiàn)參與了重要的生物學(xué)功能，如調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等［16］。lncRNA的異常表達(dá)與人類疾病密切相關(guān)，比如腫瘤、代謝性疾病等，且在相關(guān)領(lǐng)域中有望成為診斷和治療的新型靶點(diǎn)［17-18］。然而，lncRNA的變化和作用在器官I/R損傷的研究中只是冰山一角［19-21］，尤其在腸I/R中尚無(wú)深入而全面的報(bào)道。

本研究成功的復(fù)制了小鼠腸缺血再灌注模型，并且在SMA缺血60 min再灌注120 min的時(shí)間點(diǎn)獲取腸黏膜組織，應(yīng)用Arraystar小鼠lncRNA V3.0基因芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行差異表達(dá)lncRNA的篩選。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，腸I/R后小鼠腸上皮細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜發(fā)生了顯著變化。經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，總共有3602個(gè)lncRNA發(fā)生了差異性表達(dá)，其中差異倍數(shù)2倍以上共有上調(diào)lncRNA 1 503個(gè)，下調(diào)2 099個(gè)；差異倍數(shù)10倍以上的共有11個(gè)lncRNA上調(diào)，313個(gè)下調(diào)。

與此同時(shí)，本芯片篩選出小鼠腸I/R后mRNA在腸上皮細(xì)胞的表達(dá)也發(fā)生了明顯的改變。差異表達(dá)的mRNA總共有3 158個(gè)，其中差異倍數(shù)2倍以上共有1 528個(gè)上調(diào)，1 630個(gè)下調(diào)；差異倍數(shù)10倍以上26個(gè)上調(diào)，410個(gè)下調(diào)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性，我們結(jié)合lncRNA差異倍數(shù)、P值、長(zhǎng)度、表達(dá)水平等多種方法，挑選了6個(gè)lncRNA行實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AK089510、NR_002865、ENSMUST00000129245和 AK014219的驗(yàn)證結(jié)果和芯片一致；其中AK089510上調(diào)的倍數(shù)最高，ENSMUST00000129245下調(diào)的倍數(shù)最高。該結(jié)果提示AK089510、NR_002865、ENSMUST00000129245、AK014219在腸I/R損傷的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要功能，為后繼研究打下基礎(chǔ)。

圖6 10個(gè)凋亡mRNA和其高度相關(guān)的lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖（pcc≥0.995，F(xiàn)DR≤0.01）Fig.6 The co-expression networks of 10 apoptosis associated mRNAs and their highly correlated lncRNAs（pcc≥0.995，F(xiàn)DR≤0.01）

3.2 凋亡是腸I/R后小鼠腸上皮差異lncRNA表達(dá)譜富集的重要功能

腸缺血再灌注損傷是一個(gè)多因素作用的復(fù)雜病理生理過(guò)程，受氧化應(yīng)激、氧自由基、鈣超載、細(xì)胞因子、細(xì)菌感染及內(nèi)毒素刺激、腸道菌群和毒素移位、免疫反應(yīng)等多因素獨(dú)立或共同作用［22-23］。本研究結(jié)果通過(guò)計(jì)算GO分析的富集指數(shù)分析出，上調(diào)的mRNA主要與脂代謝過(guò)程、氧化還原反應(yīng)、應(yīng)激、正性調(diào)控凋亡過(guò)程/程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期、線粒體凋亡改變、MAPK級(jí)聯(lián)、凋亡的誘導(dǎo)/執(zhí)行、炎性反應(yīng)、p53介導(dǎo)凋亡、鈣離子等有關(guān)。同時(shí)，差異下調(diào)表達(dá)相關(guān)mRNA主要與多細(xì)胞生物信號(hào)、神經(jīng)沖動(dòng)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、化學(xué)穩(wěn)態(tài)、分泌、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、Wnt受體信號(hào)通路、負(fù)向調(diào)控凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、組織重構(gòu)、VEGF受體信號(hào)通路等有關(guān)。上述GO分析主要富集的功能，符合既往I/R損傷方向特別是腸I/R損傷研究的經(jīng)典理論，該結(jié)果在本lncRNA芯片中得到了很好的體現(xiàn)，同時(shí)也提示了芯片結(jié)果的可靠性。

特別值得注意的是，在位居前15位的重要GO功能中，“凋亡”這一過(guò)程，在上調(diào)和下調(diào)基因參與的生物學(xué)進(jìn)程中都占有重要位置。尤其是上調(diào)的GO分子功能條目的注釋結(jié)果顯示，涉及“apoptosis”這一術(shù)語(yǔ)相關(guān)的子條目在GO分子功能條目的注釋結(jié)果中反復(fù)多次出現(xiàn)，并且富集指數(shù)排在前列，同時(shí)涵蓋了線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)源性/外源性凋亡、凋亡誘導(dǎo)/執(zhí)行等絕大部分重要的凋亡經(jīng)典過(guò)程；這一現(xiàn)象提示腸I/R過(guò)程中“凋亡”功能發(fā)生了顯著改變，不僅符合既往對(duì)腸I/R損傷腸上皮細(xì)胞死亡方式的解讀［24-26］，也再一次提示了凋亡可能是其主要的死亡方式。

3.3 差異表達(dá)的lncRNA和凋亡基因間有著極其密切的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

由于lncRNA不編碼蛋白，其生物學(xué)功能的注釋復(fù)雜而困難。然而，基因芯片篩選lncRNA時(shí)，也篩選了同時(shí)差異表達(dá)的mRNA，我們可以從已知功能的mRNA角度出發(fā)，通過(guò)CNC共表達(dá)分析計(jì)算出與該mRNA具有相同表達(dá)模式的lncRNA，剔選出表達(dá)顯著相關(guān)的IncRNA-mRNA關(guān)系對(duì)；通過(guò)這些熟知mRNA的功能，來(lái)推導(dǎo)lncRNA的功能，將lncRNA與特定生物學(xué)進(jìn)程連系起來(lái)，從而利于揭示其作用和相關(guān)機(jī)制［27］。

因此在本部分研究中，我們挑選了芯片中代表性的已知凋亡相關(guān)mRNA與所有差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行了共表達(dá)分析。這些mRNA較全面涉及了caspase依賴（線粒體、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）/非caspase依賴、內(nèi)源性/外源性凋亡的經(jīng)典通路，同時(shí)在本研究芯片mRNA篩選結(jié)果中均為顯著差異表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)果顯示，大量的差異lncRNA和凋亡mRNA存在著高度相關(guān)性（pcc≥0.995，F(xiàn)DR≤0.01），為一對(duì)多的關(guān)系，構(gòu)成了復(fù)雜的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，提示有大量的lncRNA可能通過(guò)這些凋亡相關(guān)基因，參與了腸I/R損傷“凋亡”機(jī)制的調(diào)控。

并且，本研究中4個(gè)已驗(yàn)證的lncRNA和部分高度相關(guān)的凋亡mRNA間極有可能存在調(diào)控關(guān)系：AK089510正調(diào)控 Casp6和 Gadd45a，NR_002865正調(diào)控 Fasl，ENSMUST00000129245 負(fù)調(diào)控Bad，提示這些高度相關(guān)的共表達(dá)mRNA與上述4個(gè)lncRNA具有極其相同的表達(dá)模式，極有可能是后者調(diào)控凋亡的靶基因，下一步我們將在后繼的功能和機(jī)制研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，在本研究中我們首次采用了lncRNA V3.0芯片技術(shù)對(duì)小鼠腸I/R腸黏膜樣本進(jìn)行了研究，揭示了腸上皮細(xì)胞lncRNA和mRNA的表達(dá)情況，成功建立了腸黏膜上皮細(xì)胞在腸I/R后早期的差異變化lncRNA基因表達(dá)譜，為后續(xù)相關(guān)領(lǐng)域提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。同時(shí)，通過(guò)生物信息學(xué)深入分析lncRNA的功能角色，GO富集出調(diào)控“凋亡”是其參與腸I/R損傷的重要功能，CNC分析出差異表達(dá)的lncRNA和凋亡基因間有著極其密切的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，構(gòu)建出高度相關(guān)的IncRNA-凋亡相關(guān)mRNA關(guān)系對(duì)，將為進(jìn)一步深入研究差異表達(dá)lncRNA的功能和機(jī)制提供方向。