黃芪、穿心蓮單獨(dú)或與抗菌肽LL-37聯(lián)合應(yīng)用對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的影響

肖倩， 王展強(qiáng)， 吳行貴， 張偉錚， 石文， 張軒， 羅燕芬， 陳茶

（1.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）作為一種常見的醫(yī)院獲得性感染的革蘭氏陰性條件致病菌，常引起呼吸道、消化道感染，危害人類的健康[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)PA生物被膜（biofilm）形成時(shí)，抗藥性增強(qiáng)甚至耐藥[3-5]。目前在臨床上治療PA感染仍具有挑戰(zhàn)性，一方面是因?yàn)槎嘀啬退幘耆找嬖龆?，抗生素治療陷入困境，另一方面是因?yàn)榭股氐牟缓侠硎褂?，使PA感染患者病情遷延難治。隨著“抗生素后時(shí)代”的到來，人們開始更多地求助于非抗生素治療。黃芪（補(bǔ)益類中藥）、穿心蓮（清熱解毒類中藥）是臨床方劑配伍中常用的2味中藥，均具有抑菌殺菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫作用[6，7]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽LL-37是在人體內(nèi)唯一發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抗菌肽，具有廣譜的抗微生物活性和中和脂多糖的活性[8-12]。因此，本研究以銅綠假單胞菌為研究對(duì)象，以抗菌肽LL-37[13]為陽(yáng)性對(duì)照，觀察中藥黃芪、穿心蓮單獨(dú)使用或與抗菌肽LL-37聯(lián)合應(yīng)用對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的作用，評(píng)價(jià)黃芪、穿心蓮抗銅綠假單胞菌性能，探討其與抗菌肽LL-37是否有協(xié)同作用，為新藥物開發(fā)應(yīng)用提供新策略?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株銅綠假單胞菌野生菌株P(guān)AO1為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院鄒琳教授惠贈(zèng)。

1.2主要試劑與儀器黃芪（批號(hào)：170800541）、穿心蓮（批號(hào)：16110864）均購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司；抗菌肽LL-37（批號(hào)：JT69395）購(gòu)自南京杰肽生物科技有限公司。Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3不同濃度中藥的配制分別用去離子水浸泡黃芪、穿心蓮1 h（每100 g中藥加500 mL去離子水）。用中藥?kù)壹逯? h，冷卻后用無(wú)菌濾膜過濾，除去細(xì)菌。用LB培養(yǎng)基將中藥原液稀釋2、4、8倍，分別配成高、中、低3種質(zhì)量濃度（100、50、25g/L），置4℃保存，備用。

1.4野生菌株P(guān)AO1生物膜培養(yǎng)取-80℃保存的PAO1于血平板上復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、革蘭染色、初步生化反應(yīng)。挑取血平板上各單個(gè)菌落，在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌，調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞舛龋瑐溆?。取出配好的菌液恢?fù)至室溫，用LB培養(yǎng)基稀釋菌液100倍，置于37℃恒溫?fù)u床中平衡1 h。將長(zhǎng)寬約0.5 mm無(wú)菌硅膠片置于24孔板中，將平衡后的菌液以1 000 μL/孔加入24孔板中，復(fù)孔6個(gè)，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d[14]，隔天換液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5紫外分光光度法鑒定PAO1生物膜參考Jabalameli F等的方法[15]，取出培養(yǎng)PAO17 d的24孔板，棄去LB培養(yǎng)基。用滅菌注射用水清洗硅膠片2次以除去浮游菌，拍干后置于新的24孔板中，同時(shí)用無(wú)菌硅膠片作為陰性對(duì)照。在24孔板中以500 μL/孔加入結(jié)晶紫以固定生物膜并染色，3 min后棄去結(jié)晶紫，用滅菌注射用水清洗硅膠片3次，置于新的24孔板中，自然風(fēng)干。向24孔板中以200 μL/孔加入300 g/L醋酸，置于搖床上15 min?；靹蚝?，每孔吸取100 μL溶液于96孔板。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度[D（630 nm）]，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37對(duì)銅綠假單胞菌PAO1的MIC。取出配好的菌液恢復(fù)至室溫，每孔加入濃度為2×106CFU/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液100 μL。調(diào)整黃芪、穿心蓮各質(zhì)量濃度分為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0 g/L；調(diào)整抗菌肽LL-37質(zhì)量濃度分為1 024、512、256、128、64、32、16、0 μg/mL；無(wú)菌生理鹽水孔為陰性對(duì)照組，加菌液不加藥孔為空白對(duì)照組。以1∶1的比例加入96孔板中，每個(gè)濃度復(fù)孔3個(gè)，混勻置于CO2培養(yǎng)箱中過夜觀察結(jié)果，有細(xì)菌生長(zhǎng)孔混濁，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔清亮且對(duì)應(yīng)的最小用藥濃度即為MIC值。

1.7黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)PAO1生物膜形成的影響實(shí)驗(yàn)分組：黃芪、穿心蓮單獨(dú)用藥組（劑量均分別為100、50、25 g/L）；抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥組（劑量分別為128、64、32、16 μg/mL）；聯(lián)合用藥組（64、32 μg/mL抗菌肽LL-37+100、50、25 g/L黃芪或穿心蓮）。另設(shè)無(wú)菌生理鹽水孔為陰性對(duì)照組，未加藥PA生物膜孔為空白對(duì)照組。將無(wú)菌硅膠片置于24孔板中，取出配好的菌液和各組藥物以1∶1的比例加入24孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按“1.4”項(xiàng)制備生物膜。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度D（630 nm）值。聯(lián)合用藥時(shí)計(jì)算抑菌濃度指數(shù)（FIC）[16]（FIC=D聯(lián)合后/D聯(lián)合前，當(dāng)FIC≤0.5時(shí)，表示二者有協(xié)同作用）。

1.8黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)成熟生物膜的清除率用“1.4”項(xiàng)的方法培養(yǎng)生物膜若干，第7天時(shí)取出生物膜，置于新的24孔板中。PAO1野生菌株分別培養(yǎng)于隨機(jī)選擇的3塊硅膠片。采用紫外分光光度法測(cè)定各孔D（630 nm），檢驗(yàn)生物膜的形成能力，再將各濃度藥物以每孔1 000 μL加入24孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后再檢驗(yàn)生物膜的形成能力。按以下公式計(jì)算生物膜清除率（p）：p=[藥物處理后D（λ）-藥物處理前D（λ）]/藥物處理前D（λ）×100%。聯(lián)合用藥時(shí)計(jì)算FIC。

1.9統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1紫外分光光度法檢測(cè)銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成情況圖1結(jié)果顯示：PAO1組D（630 nm）高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示野生菌株P(guān)AO1形成生物膜。

2.2黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37最低抑菌濃度表1結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)濃度中藥黃芪、穿心蓮對(duì)PAO1無(wú)抑制作用，抗菌肽LL-37對(duì)PA的MIC為256 μg/mL。

2.3單獨(dú)用藥、聯(lián)合用藥對(duì)PA生物膜形成的影響

2.3.1 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥對(duì)PAO1生物膜形成的影響 圖2結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，不同濃度的黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥組D（630 nm）值顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且穿心蓮組、抗菌肽LL-37組降低作用更明顯；各藥物不同濃度組間D（630 nm）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示不同濃度黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥對(duì)野生菌株P(guān)AO1生物膜形成均具有抑制作用。

表1 黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Table 1 The minimum inhibitory concentration of Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37

圖1 紫外分光光度法測(cè)PAO1生物膜形成情況Figure 1 UV spectrophotometric determination results of PAO1 biofilm formation

2.3.2 黃芪與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對(duì)PAO1生物膜形成的影響 圖3結(jié)果顯示，25、50、100 g/L的黃芪分別與32、64 μg/mL的抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥不能抑制生物膜的形成。

2.3.3 穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對(duì)PAO1生物膜形成的影響 圖4結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，100 g/L穿心蓮+64 μg/mL抗菌肽LL-37、100 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、50 g/L穿心蓮+32 μg/mL 抗菌肽LL-37、25 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥組D（630 nm）值顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥可抑制生物膜的形成，但FIC＞0.5，又提示聯(lián)合用藥并未產(chǎn)生協(xié)同作用。

2.4單獨(dú)用藥、聯(lián)合用藥對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率

2.4.1 黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率 表2結(jié)果顯示：?jiǎn)斡命S芪（100、50、25 g/L）對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率分別為-47.88%、-40.21%、-43.92%，清除近一半成熟生物膜；各濃度黃芪組清除率比較，差異不明顯。穿心蓮（100、50、25 g/L），抗菌肽LL-37（128、64、32、16 μg/mL）對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率在29%～60%之間，均大于29%；隨著穿心蓮濃度的增加，PAO1成熟生物膜清除率逐漸減弱，而隨著抗菌肽LL-37濃度的增加，PAO1成熟生物膜清除率逐漸增強(qiáng)。

圖2 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥對(duì)PAO1生物膜形成的影響Figure 2 Effect of Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 alone on PAO1 biofilm formation

圖3 黃芪與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對(duì)PAO1生物膜形成的影響Figure 3 Effects of the combination of Radix Astragaliand antibacterial peptide LL-37 on PAO1 biofilm formation

圖4 穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對(duì)PAO1生物膜形成的影響Figure 4 Effects of the combination of Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 on PAO1 biofilm formation

表2 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率比較Table 2 Comparison of the clearance rate of PAO1 mature biofilm by Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 alone

2.4.2 黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率 表3結(jié)果顯示，25 g/L黃芪+32 μg/mL抗菌肽LL-37組和25 g/L黃芪+16 μg/mL抗菌肽LL-37組對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率均大于25%，其他聯(lián)合組對(duì)PAO1成熟生物膜的清除作用不理想。FIC＞0.5，提示聯(lián)合用藥抗PAO1成熟生物膜形成亦不產(chǎn)生協(xié)同作用。

3 討論

PA的群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing system，QS系統(tǒng)）在細(xì)菌致病性和耐藥性方面發(fā)揮重要作用，具有調(diào)控細(xì)菌粘附、毒力因子分泌、生物膜形成等功能[17，18]。生物膜是由細(xì)菌產(chǎn)生的基質(zhì)封閉并粘附于彼此表面或分界面的細(xì)菌群落。生物膜形成后，環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)，一方面增加對(duì)附著面的粘附性，逃避宿主的免疫作用，另一方面阻止藥物進(jìn)入到細(xì)菌內(nèi)部，使細(xì)菌耐藥性顯著增強(qiáng)。有研究指出，PA的慢性感染主要與生物膜這一生長(zhǎng)模式、低毒性和生長(zhǎng)速度慢有關(guān)，某些情況下生物膜對(duì)PA的毒力效應(yīng)具有更強(qiáng)的協(xié)同作用[19，20]。因此，破壞菌膜的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)是清除菌膜的主要治療思路，干擾細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)也是一個(gè)很有前景的途徑。

表3 黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率Table 3 Comparison of the clearance rate of PAO1 biofilms by the combination of Radix Astragali/Herba Andrographis together with antibacterial peptide LL-37

近年來，中藥已成為研究抑菌藥物的來源之一[21]，其優(yōu)勢(shì)在于中藥某些成分具有天然抗菌抑菌活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，中藥黃芪[22]、穿心蓮[23，24]從多個(gè)方面對(duì)PA的毒力因子、生物膜形成產(chǎn)生廣泛抑制作用。因此，在目前PA抗生素耐藥正處于嚴(yán)峻的形勢(shì)下，進(jìn)一步深入研究PA的致病機(jī)制以及尋找針對(duì)PA感染的非抗生素治療具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。

本研究首先成功構(gòu)建了穩(wěn)定生物膜模型，應(yīng)用紫外分光光度法測(cè)定生物膜形成能力，結(jié)果顯示PAO1組D（λ）和陰性對(duì)照組D（λ）分別為（0.126 3±0.015 2）和（0.036 0±0.001 5），按照J(rèn)abalameli F[15]的判斷標(biāo)準(zhǔn)，PAO1能形成生物膜且形成生物膜的能力為中等[2×空白對(duì)照組D（λ）＜實(shí)驗(yàn)組D（λ）≤4×空白對(duì)照組D（λ）]，表明其形成的生物膜比較穩(wěn)定。

再者，黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥對(duì)PAO1野生菌株生物膜的形成均具有抑制作用。穿心蓮和抗菌肽LL-37的抑制作用更明顯。各藥物不同濃度組間D（630 nm）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但D（630 nm）隨著濃度增加呈現(xiàn)減低趨勢(shì)，表明隨著PAO1生物膜的形成減少，藥物抑制生物膜形成能力增強(qiáng)，提示黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥可抑制PAO1生物被膜的起始，在生物膜形成的第一步就發(fā)揮了重要的干預(yù)作用，呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，與文獻(xiàn)[21]報(bào)道相符。該文獻(xiàn)[21]也報(bào)道高濃度黃芪提取液對(duì)吸光度造成干擾，同時(shí)低濃度（＜50g/L）黃芪對(duì)吸光度不造成干擾，顯示這種干擾程度在一定范圍內(nèi)較為恒定。本研究選取的黃芪濃度亦在此恒定范圍內(nèi)。

本研究觀察聯(lián)合用藥抑制生物膜形成的結(jié)果顯示：選取25、50、100 g/L的黃芪分別與32、64 μg/mL的抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥不能抑制生物膜的形成；100 g/L穿心蓮+64 μg/mL抗菌肽LL-37、100 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、50 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、25 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥均能抑制生物膜的形成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明在生物膜形成早期，聯(lián)合應(yīng)用一定濃度的穿心蓮+抗菌肽LL-37具有明顯的抑制作用；但是聯(lián)合用藥尚未產(chǎn)生協(xié)同作用（FIC＞0.5），提示二者配伍使用不能達(dá)到較好的抑菌作用。

本研究觀察黃芪、穿心蓮、抑菌肽LL-37單獨(dú)用藥對(duì)已經(jīng)形成的成熟PAO1生物膜的清除作用，用清除率表示。黃芪（100、50、25 g/L）對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率分別為-47.88%、-40.21%和-43.92%，清除近一半成熟生物膜。穿心蓮（100、50、25 g/L）、抗菌肽LL-37（128、64、32、16 μg/mL）對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率均在29%～60%之間，均大于29%。黃芪各濃度的清除作用差異不明顯。穿心蓮隨濃度增加，對(duì)PAO1成熟生物膜的清除作用反而減弱?？咕腖L-37隨濃度增加，對(duì)PAO1成熟生物膜的清除作用越明顯，具有濃度依賴性，顯示出抗菌肽LL-37預(yù)防和治療難治性生物膜感染的巨大潛力。

本研究觀察聯(lián)合用藥對(duì)成熟生物膜抑制作用，研究結(jié)果顯示，25 g/L黃芪+32 μg/mL抗菌肽LL-37、25 g/L黃芪 +16 μg/mL 抗菌肽LL-37對(duì)PAO1成熟生物膜的清除率均大于25%。其他聯(lián)合組對(duì)PAO1成熟生物膜的清除作用不理想，對(duì)此現(xiàn)象有待進(jìn)一步探討。聯(lián)合用藥抗PAO1成熟生物膜形成也不產(chǎn)生協(xié)同作用（FIC＞0.5）

綜上所述，黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨(dú)用藥均能夠早期抑制PAO1生物膜的形成，呈現(xiàn)濃度依賴性，并且在一定程度上清除成熟的生物膜。黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，不具有協(xié)同作用。下一步擬在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中以驗(yàn)證其效。