10 種復(fù)方中草藥對(duì)鱘源海豚鏈球菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)的研究

袁國(guó)尚 張安青 姚 麗 何柯微 吳洪臣 姜海波,4 文 明 邵 儉 唐 黎,4

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.銅仁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局漁業(yè)技術(shù)推廣站，貴州 銅仁 554300；4.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

我國(guó)是鱘魚(yú)養(yǎng)殖量最大的國(guó)家，也是鱘魚(yú)種類分布較多的國(guó)家，鱘魚(yú)具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值，然而一直以來(lái)疾病是威脅眾多養(yǎng)殖戶的一個(gè)重大問(wèn)題。細(xì)菌性疾病在我國(guó)魚(yú)類的養(yǎng)殖中尤為普遍與常見(jiàn)，廣大的養(yǎng)殖戶都在使用抗生素類藥物進(jìn)行治療，過(guò)多和長(zhǎng)期性地使用抗生素類藥物不僅會(huì)加劇養(yǎng)殖水環(huán)境的破壞，還會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，不利于病害的治療。因此，尋找能替代抗生素且不會(huì)污染養(yǎng)殖水域環(huán)境的藥物成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的一個(gè)重要研究方向。中草藥不僅具有一定的抗菌效果，而且還具有來(lái)源廣泛、毒副作用小、殘留少、污染小等優(yōu)點(diǎn)，成了替代抗生素的優(yōu)選。

海豚鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛分布于自然水體、土壤以及食物當(dāng)中。海豚鏈球菌對(duì)魚(yú)類感染力強(qiáng)，易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)相關(guān)的研究，藿香、豨薟草、槐角、博落回、紫草、田基黃、補(bǔ)骨脂、三顆針、田七須和五倍子等中草藥對(duì)海豚鏈球菌均有不同程度的抑制效果。中草藥可直接作用于病原菌的細(xì)胞壁，抑制病原菌細(xì)胞壁的形成，影響或破壞其生長(zhǎng)、繁殖和代謝從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目的。因此，本研究選取了小柴胡湯、芍藥湯和玉屏風(fēng)散等10味復(fù)方中草藥，研究其對(duì)鱘源海豚鏈球菌的體外抑菌作用，為使用中草藥預(yù)防和治療海豚鏈球菌疾病提供一定的理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)菌株 鱘源海豚鏈球菌為北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站提供。

2.實(shí)驗(yàn)藥物 選取小柴胡湯、芍藥湯、玉屏風(fēng)散、痛泄要方、黃連解毒湯、升麻葛根湯、茵陳蒿湯、小青龍湯、大承氣湯和豬苓湯10種具有消炎抗菌等功效的復(fù)方中草藥為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)前將10種復(fù)方中的全部單味中草藥分別粉碎后過(guò)60目篩，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

3.中草藥復(fù)方組合及藥液制備 根據(jù)《方劑學(xué)》按照比例組合成10種復(fù)方中草藥(表1)，用水提法制備所需的藥液，即稱取所需中草藥粉末置于紗布之中，保證藥物不能漏出紗布；取陶制罐，將藥包置于陶制罐中，加入超出藥物表面5厘米的蒸餾水，浸泡1小時(shí)；武火沸騰后轉(zhuǎn)文火，30分鐘后取藥液，重復(fù)3次，后將所有藥液混合濃縮，使其終濃度為1000毫克/毫升，離心后，取上清液121℃高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 復(fù)方中草藥組合

4.菌懸液的制備 取保藏菌種，接種在固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24小時(shí)。挑取單菌落于TSB液體試管中進(jìn)行搖床培養(yǎng)24小時(shí)(28℃，140轉(zhuǎn)/分)，調(diào)整菌液濃度為2×108～3×108CFU/毫升，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.中藥平板抑菌實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法，即使用直徑為9厘米的培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿平均內(nèi)分為3個(gè)區(qū)域，然后在3個(gè)區(qū)域中央固定位置放置一個(gè)高為(10±0.1)毫米、外徑為(8±0.1)毫米、內(nèi)徑為(6±0.1)毫米的牛津杯，使其成為正三角形的結(jié)構(gòu)，并且牛津杯兩兩之間的距離不得小于3厘米，避免抑菌圈的重疊進(jìn)而影響抑菌圈的測(cè)定。待滅菌的培養(yǎng)基冷卻至50℃時(shí)均勻倒入培養(yǎng)皿，待其凝固后取出牛津杯，做好標(biāo)記。各培養(yǎng)皿加入100微升的菌液，后用無(wú)菌棒涂抹均勻，在培養(yǎng)皿相應(yīng)孔中分別加入100微升藥液。每種藥液需要設(shè)3個(gè)平行組，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(涂菌、打孔、加強(qiáng)力霉素)和空白對(duì)照(涂菌、打孔、加雙蒸餾水)，將培養(yǎng)皿放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，用游標(biāo)卡尺精準(zhǔn)測(cè)量抑菌直徑。每孔取不同方向測(cè)量?jī)纱?，最終求取3個(gè)平板共6次測(cè)量結(jié)果的平均值，以代表該種藥液抑菌效果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑＜10毫米為低度敏感(-)，10～20毫米為中度敏感(＋)，＞20毫米為高度感(＋＋)。

6.最小抑菌濃度 采用二倍稀釋法測(cè)定各組藥的最小抑菌濃度(MIC)，即在無(wú)菌環(huán)境下，首先取13只帶有棉塞的試管(15毫米×150毫米)，然后對(duì)試管進(jìn)行1～13編號(hào)。在編號(hào)為1～11的試管中加入2.5毫升的液體培養(yǎng)基，后在1號(hào)試管中加入2.5毫升的原藥液，然后從1號(hào)試管中吸取2.5毫升的混合液到2號(hào)試管，再?gòu)?號(hào)試管中取2.5毫升的混合液到3號(hào)試管，依次吸取2.5毫升到11號(hào)試管，后再?gòu)?1號(hào)試管中吸取2.5毫升丟棄。最后在1～11號(hào)試管中各加入100微升菌液，搖勻，12號(hào)試管中加菌液不加藥液作為生長(zhǎng)對(duì)照組，13號(hào)試管號(hào)中加藥液不加菌液作空白對(duì)照。每種中草藥重復(fù)3次，最后放置28℃的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后觀察1～13號(hào)試管內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)情況，其中無(wú)菌生長(zhǎng)的最高稀釋濃度即為MIC。

7.最小殺菌濃度 在MIC實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果，清澈透明無(wú)混濁現(xiàn)象的試管即為無(wú)菌生長(zhǎng)試管。無(wú)菌生長(zhǎng)試管中的最低藥物質(zhì)量濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)。

8.數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

二、結(jié)果

1.復(fù)方中草藥水提物的抑菌圈測(cè)定 10種復(fù)方中草藥對(duì)海豚鏈球菌的抑制效果見(jiàn)表2，從表中我們可以看到鱘源海豚鏈球菌對(duì)小柴胡湯、芍藥湯和玉屏風(fēng)散呈現(xiàn)為高度敏感，其抑菌直徑分別為(25.34±0.37)、(24.52±1.03)、(23.26±0.41)毫米；鱘源海豚鏈球菌對(duì)痛泄要方、黃連解毒湯、茵陳蒿湯和升麻葛根湯呈現(xiàn)為中度敏感，其抑菌直徑分別為(17.45±0.83)、(15.75±0.57)、(14.89±2.18)、(14.49±1.07)毫米，鱘源海豚鏈球菌對(duì)小青龍湯、大承氣湯和豬苓湯呈現(xiàn)為低度敏感。

表2 復(fù)方中草藥水提物對(duì)海豚鏈球菌的體外抑菌活性

2.復(fù)方中草藥的MIC和MBC 復(fù)方中草藥對(duì)于鱘源海豚鏈球菌的MIC和MBC見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芍藥湯的MIC和MBC最明顯，分別為31.25毫克/毫升和62.5毫克/毫升。其次為小柴胡湯，其MIC和MBC分別為31.25毫克/毫升和125毫克/毫升。而玉屏風(fēng)散的MIC和MBC為62.5毫克/毫升和125毫克/毫升。黃連解毒湯、茵陳蒿湯、痛泄要方和升麻葛根湯的MIC分別為125、125、125、125毫克/毫升，其 MBC分別為 250、500、500、500毫克/毫升。

表3 復(fù)方中草藥對(duì)海豚鏈球菌的MIC和MBC

三、討論

本文對(duì)小柴胡湯、芍藥湯和玉屏風(fēng)散等10種復(fù)方中草藥的抗海豚鏈球菌的活性進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，鱘源海豚鏈球菌對(duì)于小柴胡湯、芍藥湯和玉屏風(fēng)散高度敏感，其抑菌圈直徑分別達(dá)到了(25.34±0.37)、(24.52±1.03)、(23.26±0.41)毫米，小柴胡湯、芍藥湯和玉屏風(fēng)散的MIC分別為31.25、31.25、62.5毫克/毫升，其MBC分別為125、62.5、125毫克/毫升。同時(shí)有研究表明，這3種方劑在抑菌方面有很好的效果。據(jù)袁長(zhǎng)津等的研究，小柴胡湯及其加減方對(duì)乙型溶血性鏈球菌、嗜血流感桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、大腸埃希菌均有不同程度的抑制效果，小柴胡湯對(duì)上述病原菌的MIC分別為200.00、100.00、100.00、250.00、200.00毫克/毫升。據(jù)遲丹的研究，芍藥湯在臨床上治療細(xì)菌性的痢疾具有明顯的效果，在其治療組19例中,治愈11例(57.9%)、 有 效6例(31.6%)、 無(wú) 效2例(10.5%)，總有效率為89.5%。據(jù)吳亞等的研究，玉屏風(fēng)散對(duì)熱帶假絲酵母菌具有良好的抑菌效果，其MIC在50～200毫克/毫升。據(jù)吳穎瑞等的研究，甘草、黃連對(duì)羅非魚(yú)源海豚鏈球菌均有一定的抑制效果，而這兩味藥剛好是小柴胡湯和芍藥湯中的組成成分，而復(fù)方中草藥有更強(qiáng)的抑菌效果，這與鄧凱偉等在對(duì)引發(fā)奶牛隱性乳腺炎的金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)所得出的結(jié)論相一致，即復(fù)方中草藥因?yàn)槠浜侠淼呐湮樽饔?，能發(fā)揮出藥物間的相輔相成作用，可增強(qiáng)單方中草藥的抑菌作用。

在本研究中，鱘源海豚鏈球菌對(duì)黃連解毒湯、茵陳蒿湯、痛泄要方和升麻葛根湯為中度敏感，其抑菌直徑都在14.49～17.45毫米。據(jù)劉平等的研究，黃連解毒湯對(duì)大腸埃希菌的最小抑菌濃度為125毫克/升，對(duì)肺炎克雷伯菌最小抑菌濃度為125毫克/升，與本實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)相一致。朱江等研究表明，茵陳蒿湯在消炎鎮(zhèn)痛方面有顯著的效果。據(jù)李輝等報(bào)道，痛泄要方在治療小兒腸系膜淋巴結(jié)炎中有顯著的作用。據(jù)秦汝蘭等報(bào)道，升麻葛根湯對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有顯著的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為50、100毫克/毫升，其實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和本實(shí)驗(yàn)中對(duì)鱘源海豚鏈球菌的最小抑菌濃度有所差異，可能是因?yàn)楣┰嚲辍?shí)驗(yàn)地點(diǎn)、藥液制備方法等有所差異造成的。

四、結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)條件下研究發(fā)現(xiàn)小柴胡湯、芍藥湯和玉屏風(fēng)散對(duì)鱘源海豚鏈球菌具有明顯的抑制性，但其體外抑菌的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究明確，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)的部分復(fù)方中草藥具有明顯的抑菌作用，但是能否運(yùn)用到漁藥開(kāi)發(fā)上還有待進(jìn)一步的實(shí)踐。