Klotho抑制腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制

繆靜龍，劉其鋒

(江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇 昆山215300)

Klotho是1997年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，Klotho基因表達(dá)缺失的小鼠表現(xiàn)出類似人類衰老的癥狀及體征，因而是一種抗衰老基因[1]。Klotho基因位于第13號(hào)染色體(13q12)上，根據(jù)其基因結(jié)構(gòu)的不同，可表達(dá)膜型及可溶性兩種Klotho蛋白；膜型Klotho是定位于細(xì)胞膜的單鏈跨膜蛋白，由全部Klotho基因編碼生成，但其胞外區(qū)可以被水解脫落生成可溶性Klotho，可溶性Klotho也可來(lái)源于Klotho信使RNA的可變修飾生成[2]。膜型Klotho和可溶性Klotho的表達(dá)密切相關(guān)，膜型Klotho的減少會(huì)導(dǎo)致可溶性Klotho的同步減少；兩者功能類似，但又有所區(qū)別：膜型Klotho主要作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)23的協(xié)同受體，與FGF-23形成復(fù)合物后參與機(jī)體鈣磷代謝的調(diào)節(jié)；而可溶性Klotho可以隨血液、體液等全身播撒，作用于相應(yīng)的靶器官發(fā)揮一定的生物學(xué)等作用[3-4]。隨著對(duì)Klotho生物學(xué)認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其功能早已超越了“抗衰老”的范疇(如抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抑制血管鈣化、抑制細(xì)胞凋亡及組織器官纖維化等)，而Klotho對(duì)纖維化的抑制作用尤其值得關(guān)注[5]。研究證實(shí)，Klotho主要表達(dá)于腎臟，Klotho的表達(dá)異常也與慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)相關(guān)的腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)發(fā)生發(fā)展相關(guān)，被認(rèn)為是腎臟纖維化的標(biāo)志物之一[6]?，F(xiàn)就Klotho抑制RIF的作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 Klotho抑制RIF的作用及機(jī)制

Klotho的腎臟保護(hù)效應(yīng)是多因素的，其中對(duì)RIF的抑制是Klotho發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的一個(gè)重要方面[7]。RIF是CKD最主要的病理特征，也是多種腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的最終通路。RIF與腎功能密切相關(guān)，抑制RIF也是CKD防治的重要干預(yù)靶點(diǎn)。有研究表明，腎組織Klotho表達(dá)量與RIF及腎小球硬化程度負(fù)相關(guān)，而給予外源性可溶性Klotho可減輕RIF程度，改善腎功能，證實(shí)了Klotho對(duì)RIF的抑制作用[6,8]。證據(jù)顯示，Klotho可以調(diào)控體內(nèi)多條致纖維化信號(hào)通路，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、Wnt/β-聯(lián)蛋白(β-catenin)、腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)、FGF-2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)等多條纖維化相關(guān)信號(hào)通路，從而多靶點(diǎn)抑制RIF的發(fā)生發(fā)展[7]。

1.1抑制TGF-β1信號(hào)通路 TGF-β1及其下游Smads蛋白是經(jīng)典的致纖維化通路，TGF-β1與其受體結(jié)合后，通過(guò)調(diào)控Smads蛋白的磷酸化而激活致纖維化基因的轉(zhuǎn)錄，其中Smad2/3起正調(diào)控作用，Smad7通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TGF-β1的受體阻斷Smad2/3的磷酸化，負(fù)向調(diào)控TGF-β1的作用。一項(xiàng)關(guān)于糖尿病腎病患者的調(diào)查表明，血清可溶性Klotho水平隨著蛋白尿的增加逐漸下降，而血清TGF-β1的水平逐漸升高，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)[9]，提示Klotho的減少可能與TGF-β1信號(hào)的激活有關(guān)。在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎臟纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，Klotho基因缺陷會(huì)加重TGF-β1誘導(dǎo)的RIF的形成，而野生型小鼠或給予外源性可溶性Klotho治療則抑制了TGF-β1導(dǎo)致的RIF[10]。近期的研究也發(fā)現(xiàn)，Klotho基因剔除會(huì)導(dǎo)致TGF-β1及其下游信號(hào)的激活，加重UUO誘導(dǎo)的RIF[11]。在糖尿病腎病模型中，Klotho缺失在不影響腎臟血流的情況下，促進(jìn)了腎小球的肥大及系膜基質(zhì)的增生，上調(diào)了TGF-β1及磷酸化Smad2的表達(dá)，而Klotho表達(dá)增加則可逆轉(zhuǎn)以上改變[12]。體外實(shí)驗(yàn)表明，Klotho抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cell，RTC)內(nèi)TGF-β1的活性，并降低TGF-β1的Ⅱ型受體含量，減少纖維化標(biāo)志物的產(chǎn)生[13]。綜上，證實(shí)了Klotho對(duì)TGF-β1及其下游纖維化信號(hào)的抑制作用。在Klotho抑制TGF-β1信號(hào)的機(jī)制研究中，Doi等[14]發(fā)現(xiàn)，可溶性Klotho與TGF-β1的Ⅱ型受體有較高的親和力，可溶性Klotho與TGF-β1的Ⅱ型受體結(jié)合后影響了與TGF-β1的結(jié)合，干擾了TGF-β1和Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，類似于Smad7轉(zhuǎn)錄抑制作用，這可能是Klotho抑制TGF-β1信號(hào)的機(jī)制，但這種結(jié)合是競(jìng)爭(zhēng)性的或是由變構(gòu)效應(yīng)導(dǎo)致的尚不明確。

1.2干擾Wnt/β-catenin信號(hào)通路 經(jīng)典Wnt信號(hào)的激活也與器官纖維化包括腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[15]。Wnt蛋白是一種分泌型糖蛋白，共有19種，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的起始蛋白。正常細(xì)胞內(nèi)β-catenin與其他物質(zhì)形成復(fù)合物，導(dǎo)致β-catenin 的磷酸化而被蛋白酶降解，使胞內(nèi)游離的β-catenin處于低水平狀態(tài)；當(dāng)Wnt信號(hào)激活后抑制了β-catenin磷酸化，導(dǎo)致胞內(nèi)游離的β-catenin增多而移位，致細(xì)胞核與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控下游多種與纖維化有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄(fibronectin、基質(zhì)金屬蛋白酶7、Twist及Snail等)[16]。在衰老的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Klotho缺失引起Wnt信號(hào)的激活并觸發(fā)了細(xì)胞老化，說(shuō)明Klotho對(duì)Wnt信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用[17]。在UUO模型中也發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)的多種成分(如Wnts、β-catenin、fibronectin)的表達(dá)在RIF中明顯上調(diào)，而Klotho轉(zhuǎn)基因小鼠RIF減輕，同時(shí)Wnts、β-catenin、fibronectin的表達(dá)也明顯減少[18]。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，可溶性Klotho對(duì)心肌細(xì)胞和RTC細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有抑制作用[18-19]。在阿霉素誘導(dǎo)的腎損傷模型中，隨著腎損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，腎組織可溶性Klotho的表達(dá)強(qiáng)度逐漸減少，而β-catenin 的強(qiáng)度卻逐漸增多，且兩者呈負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，可溶性Klotho一方面能與免疫標(biāo)記的Wnt1、Wnt4或Wnt7a等結(jié)合形成復(fù)合物；另一方面Klotho也直接抑制了β-catenin的核內(nèi)移位[20]，說(shuō)明Klotho通過(guò)干擾Wnt和β-catenin的作用使經(jīng)典的Wnts/β-catenin致纖維化通路失活。

1.3抑制腎臟EMT EMT是指上皮細(xì)胞失去原有的細(xì)胞表型，而獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程，發(fā)生EMT的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變，在腫瘤轉(zhuǎn)移及纖維化形成中發(fā)揮重要作用[21]。RIF伴隨大量肌纖維母細(xì)胞的激活，繼而產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)RIF發(fā)生發(fā)展。有研究表明，RTC經(jīng)EMT途徑可以產(chǎn)生RIF所需的大約36%的肌纖維母細(xì)胞[22]。雖然近年來(lái)對(duì)EMT在器官纖維化中的作用有爭(zhēng)議，但并不能完全否認(rèn)EMT的作用[23]。在經(jīng)典的UUO模型中，Klotho基因缺失可以上調(diào)腎組織肌纖維母細(xì)胞標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)上皮性標(biāo)志物上皮鈣黏素(E-cadherin)的表達(dá)，減輕RIF[10]。EMT的激活及Klotho的減少也是環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)腎毒性的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制。近期的研究顯示，CsA引起了腎組織EMT標(biāo)志物的改變，外源性可溶性Klotho治療緩解了CsA誘導(dǎo)的腎組織EMT過(guò)程，抑制了CsA相關(guān)的RIF[24]。體外實(shí)驗(yàn)表明，可溶性Klotho可以使FGF-2刺激的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞2(human kidney-2 cell， HK-2)細(xì)胞形態(tài)向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并上調(diào)HK-2細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)，抑制α-SMA的表達(dá)[25]，這表明可溶性Klotho抑制了FGF-2誘導(dǎo)的EMT。來(lái)自Klotho基因變異小鼠的RTC體外分離培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)，Klotho缺失增強(qiáng)了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT改變[26]。通過(guò)藥物間接增加腎臟Klotho的合成，顯著抑制腎臟α-SMA的表達(dá)，上調(diào)了E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了Klotho對(duì)EMT的抑制作用[27]。Klotho抑制EMT的機(jī)制尚不明確。TGF-β1是引起EMT過(guò)程的主要細(xì)胞因子，而Snail則是調(diào)控EMT的主要轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)又是Wnt/β-catenin的主要下游靶基因，因此，Klotho對(duì)EMT的影響可能是通過(guò)間接調(diào)控TGF-β1和Wnt/β-catenin通路實(shí)現(xiàn)的。

1.4調(diào)控RAS RAS的激活在CKD發(fā)病及進(jìn)展中的作用已經(jīng)取得共識(shí)，對(duì)RAS的抑制是延緩CKD進(jìn)展的一個(gè)主要干預(yù)靶點(diǎn)。RAS的激活、Klotho降低以及FGF-23水平的升高是CKD患者的共有特征，它們之間存在復(fù)雜的交叉對(duì)話，RAS的激活降低了Klotho的表達(dá)，而Klotho也調(diào)控了RAS的活性，協(xié)同參與了CKD的進(jìn)展[28]。在5/6腎切除模型、UUO及阿霉素腎病模型中均發(fā)現(xiàn)，模型組動(dòng)物腎組織Klotho的表達(dá)顯著降低，而RAS的多種成分(如腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)的表達(dá)顯著提高，Klotho基因轉(zhuǎn)染則抑制了上述物質(zhì)及纖維化因子TGF-β1、α-SMA的表達(dá)，改善了腎臟病變；體外實(shí)驗(yàn)也表明，可溶性Klotho能劑量依賴性地抑制RTC細(xì)胞內(nèi)腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶及纖維化因子的表達(dá)[29]。在另一個(gè)阿霉素腎病模型中發(fā)現(xiàn)，模型組動(dòng)物血清及腎組織中腎素、血管緊張素Ⅱ表達(dá)上調(diào)，Klotho表達(dá)下降，而外源性可溶性Klotho治療則減少了腎素、血管緊張素Ⅱ的表達(dá)，緩解了RIF；而在Klotho抑制RAS的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，若同時(shí)應(yīng)用Wnt/β-catenin抑制劑則阻斷了Klotho對(duì)RAS的抑制作用，說(shuō)明Klotho對(duì)RAS的調(diào)控可能部分依賴于Wnt/β-catenin的作用[30]。已有研究表明，所有RAS成分基因的啟動(dòng)子區(qū)域均含有β-catenin的結(jié)合位點(diǎn)，因此，Wnt/β-catenin 作為RAS上游調(diào)控因子調(diào)控了RAS的表達(dá)[31]，Klotho對(duì)RAS的抑制可能與Wnt/β-catenin有關(guān)。

1.5抑制FGF-2信號(hào)通路 FGF-2也是一個(gè)促纖維化因子，參與了肝臟、心肌及肺組織的纖維化的過(guò)程，也與腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[32]。研究表明，F(xiàn)GF-2及其受體在RIF中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與RIF的程度密切相關(guān)[33]。FGF-2與其腎組織FGF-2的1型受體結(jié)合后，導(dǎo)致下游胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2的磷酸化而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄；可溶性Klotho可以抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)FGF-2水平及下游ERK1/2的激活，抑制腫瘤的增生及轉(zhuǎn)移，說(shuō)明Klotho對(duì)FGF-2信號(hào)具有調(diào)控作用[34]。體內(nèi)研究表明，外源性可溶性Klotho治療降低了UUO模型中FGF-2的水平，同時(shí)抑制了ERK1/2的激活及肌纖維母細(xì)胞的激活，減輕了RIF；體外實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)，一方面可溶性Klotho可以劑量依賴性地降低FGF-2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ERK1/2的磷酸化，同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)性地與FGF-2的1型受體結(jié)合；另一方面FGF-2可以使培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，同時(shí)上皮性標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，肌纖維母細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)增多，而可溶性Klotho干預(yù)后FGF-2及ERK1/2的磷酸化水平均降低，并逆轉(zhuǎn)了HK-2細(xì)胞形態(tài)改變以及E-cadherin 和α-SMA的表達(dá)，說(shuō)明可溶性Klotho對(duì)FGF-2信號(hào)的抑制也影響了腎臟EMT過(guò)程[25]。目前已知，Klotho是FGF因子的協(xié)同受體，可與FGF受體結(jié)合形成復(fù)合物。Klotho與FGF-23受體結(jié)合后可以促進(jìn)FGF-23的結(jié)合，發(fā)揮鈣磷調(diào)節(jié)的作用，但與FGF-2受體結(jié)合后干擾了FGF-2與其受體的結(jié)合[35]，從而抑制了FGF-2介導(dǎo)的致纖維化過(guò)程。

1.6抑制ERS ERS是新發(fā)現(xiàn)的與器官纖維化有關(guān)的通路。研究表明，UUO誘導(dǎo)的RIF伴隨ERS標(biāo)志物的大量表達(dá)，表明ERS被激活，而抑制ERS能緩解UUO誘導(dǎo)的RIF[36]，說(shuō)明ERS也是RIF發(fā)生的一個(gè)促進(jìn)因素[37-38]。缺氧及氧化應(yīng)激等是ERS的常見(jiàn)激活誘因，而Klotho具有抗氧化作用，推測(cè)Klotho可能對(duì)ERS具有調(diào)節(jié)作用。來(lái)自冠心病患者的心肌活檢顯示，心肌細(xì)胞Klotho的表達(dá)明顯減少，而ERS標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)顯著增多，說(shuō)明Klotho的減少可能與ERS的激活有關(guān)[39]。Song等[40]發(fā)現(xiàn)，異丙腎上腺素可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞大量活性氧的產(chǎn)生，并上調(diào)ERS標(biāo)志物[如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、熱激蛋白47及C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)]的表達(dá)，而可溶性Klotho干預(yù)后則減少了活性氧類的產(chǎn)生，抑制ERS標(biāo)志物的表達(dá)，緩解了ERS相關(guān)的心肌肥厚。體外實(shí)驗(yàn)也表明，可溶性Klotho緩解了藥物誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ERS反應(yīng)，減輕活性氧類導(dǎo)致的HK-2損傷，而Klotho基因剔除則阻斷了這種保護(hù)效應(yīng)[41]。進(jìn)一步的研究也證實(shí)，UUO引起的RIF伴隨腎組織ERS標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白等的增多，而可溶性Klotho替代治療下調(diào)了這些標(biāo)志物的含量，抑制了ERS，并減輕了RIF[42]。因此，可溶性Klotho對(duì)ERS具有調(diào)節(jié)作用，調(diào)控ERS的機(jī)制可能與其對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)控有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確。

總之，RIF發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，多條致纖維化通路之間也存在復(fù)雜的交叉對(duì)話，而Klotho抗RIF的作用也是多靶點(diǎn)的。除了以上機(jī)制以外，Klotho能否調(diào)控其他與纖維化有關(guān)的通路(如哺乳類動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、Toll樣受體等信號(hào)通路)，還需要在以后的研究中進(jìn)一步闡明。

2 Klotho的應(yīng)用價(jià)值

RIF是CKD進(jìn)展至終末期腎病的最終通路，而Klotho表現(xiàn)出明顯的RIF抑制作用，這為CKD相關(guān)RIF的防治提供了新方向，值得關(guān)注。目前已知，CKD伴隨Klotho的明顯減少，而Klotho的減少反過(guò)來(lái)又加重了RIF的程度，促進(jìn)了CKD的進(jìn)展。因此，調(diào)控體內(nèi)Klotho的表達(dá)，理論上具有抑制RIF防治CKD的作用。通過(guò)基因工程手段導(dǎo)入Klotho的基因序列是提高Klotho水平的理想調(diào)控手段，但目前只限于基礎(chǔ)研究；而直接給予外源性Klotho替代治療，是發(fā)揮Klotho抑制RIF的最直接手段，這在多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)[19, 24, 42]。而通過(guò)藥物間接調(diào)控體內(nèi)Klotho的表達(dá)，也是發(fā)揮Klotho作用的一個(gè)新方法。我國(guó)傳統(tǒng)中藥單體(如姜黃素和大黃酸)，被證實(shí)可以上調(diào)Klotho的表達(dá)水平，緩解了CsA或UUO誘導(dǎo)的RIF[43-44]。RAS抑制劑纈沙坦也被證實(shí)可上調(diào)糖尿病患者血清可溶性Klotho濃度，而可溶性Klotho水平的上升伴隨白蛋白尿的減少及糖尿病腎病進(jìn)展的延緩[45]。抗氧化劑也被發(fā)現(xiàn)能劑量依賴性地升高CsA腎毒性動(dòng)物模型中腎組織Klotho的表達(dá)，緩解 RIF[46]。綜上，說(shuō)明通過(guò)多種手段，直接或間接增加Klotho的表達(dá)，確實(shí)能減輕RIF，這對(duì)RIF的防治而言意義重大，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 小 結(jié)

RIF的發(fā)生發(fā)展涉及多種細(xì)胞因子、信號(hào)通路的作用，因而其防治也是多靶點(diǎn)、綜合治療的過(guò)程。作為重要的腎臟保護(hù)因子，Klotho顯示出了調(diào)控多種信號(hào)通路的致纖維化效應(yīng)，通過(guò)多靶點(diǎn)的作用最終發(fā)揮RIF的抑制功能，是一個(gè)很有發(fā)展前途的抗RIF因子。然而，CKD被認(rèn)為是腎臟保護(hù)因子Klotho的缺乏狀態(tài)，而Klotho的缺乏可能進(jìn)一步加劇RIF，長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，也增加了腎功能惡化的風(fēng)險(xiǎn)，這在近期的前瞻性研究中已被證實(shí)[47-48]。因此，將來(lái)如何以Klotho為設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，調(diào)控Klotho的表達(dá)，進(jìn)而充分發(fā)揮Klotho的抗纖維化作用，對(duì)RIF的防治而言可能是一個(gè)新的干預(yù)策略，值得進(jìn)一步研究。