微RNA調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展

王宏潤(rùn)，李宏宇

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000； 2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，南寧 530021)

間充質(zhì)干細(xì)胞具有來(lái)源方便，易分離、培養(yǎng)擴(kuò)增、純化及多向分化和增殖能力，其可在適宜的體外環(huán)境多向分化，具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及肝細(xì)胞等分化的特性，這使其在重建退化組織及相關(guān)骨疾病的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景[1]。微RNA(microRNA，miRNA)是由19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其主要參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)，廣泛存在于各個(gè)生物群體中，miRNA的分子結(jié)構(gòu)包括非編碼區(qū)(untrans-lated region，UTR)及內(nèi)含子間隔開的編碼區(qū)。大量研究表明，miRNA在生物細(xì)胞的增殖、分化，病毒感染及腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中起關(guān)鍵作用[2-4]。miRNA的產(chǎn)生是由RNA聚合酶Ⅱ與DNA生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)，pri-miRNA典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)核糖核酸酶Ⅲ內(nèi)切酶加工后由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)，生成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA，前體miRNA在細(xì)胞質(zhì)中核酸酶與RNA解旋酶的作用下生成miRNA[5]。miRNA的作用之一為通過(guò)與信使RNA編碼區(qū)及UTR的不完全互補(bǔ)配對(duì)，在后續(xù)的細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育過(guò)程中起重要作用。而miRNA的另一作用為通過(guò)與靶基因3′UTR非完全配對(duì)抑制靶基因翻譯。此外，在成骨過(guò)程中miRNA也發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)就miRNA調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)成骨分化的研究進(jìn)展予以綜述。

1 miRNA在成骨分化過(guò)程的作用

miRNA可調(diào)控不同細(xì)胞的成骨分化[6]，但目前對(duì)miRNA中特異性作用于BMSC成骨分化的基因家族研究較少。近年來(lái)，miRNA的修飾功能在間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控成骨分化中起關(guān)鍵作用[7]。miRNA通過(guò)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)影響成骨分化過(guò)程，不同轉(zhuǎn)錄因子作用于間充質(zhì)干細(xì)胞，使其分化為成骨細(xì)胞[Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子Osterix、β聯(lián)蛋白(β-catenin)、活化轉(zhuǎn)錄因子4、Smads、Satb2等]與破骨細(xì)胞 (轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、Pu．1、核因子κB、活化T細(xì)胞核因子c1等)[8-11]。研究表明，miRNA不僅具有促進(jìn)成骨分化的作用，也有抑制成骨分化的作用，如miR-26a可以通過(guò)成骨分化的經(jīng)典通路[骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-Smads通路]增加人脂肪來(lái)源干細(xì)胞基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨分化[12]；miR-125b通過(guò)對(duì)目標(biāo)靶基因Cbfβ進(jìn)行調(diào)控，減少成骨標(biāo)志基因的表達(dá)，從而抑制成骨分化[13]。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量miRNA在成骨分化過(guò)程中的作用，但其具體機(jī)制尚不明確。

2 與BMSC成骨分化相關(guān)的信號(hào)通路

BMSC具有較高的復(fù)制能力，在體內(nèi)或合適的體外環(huán)境中通過(guò)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)可使其分化成各種細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞。BMSC成骨分化過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)通路除BMP-Smads信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路3條經(jīng)典信號(hào)通路外，還有促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路、核因子κB受體活化因子信號(hào)通路等，它們?cè)诔晒欠只^(guò)程也起重要作用。

2.1BMP-Smads信號(hào)通路 BMP作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族成員之一，在成骨分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，其不僅在成骨分化中作用突出，也在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖及相關(guān)腫瘤形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BMP-Smads信號(hào)通路通過(guò)配體BMP與細(xì)胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，促進(jìn)下游信號(hào)蛋白中的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化，將細(xì)胞外的信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮多種生物功能[14-16]。Smads作為胞質(zhì)中的蛋白因子是BMP信號(hào)通路中的一個(gè)重要因子，其在體內(nèi)參與相關(guān)調(diào)節(jié)時(shí)與其他通路交互作用組成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。實(shí)驗(yàn)證明，BMP作為最早的骨形態(tài)發(fā)生信號(hào)因子，特異性誘導(dǎo)骨形成及其細(xì)胞分化[17]。BMP在細(xì)胞外與相應(yīng)受體(BMP受體Ⅰ和BMP受體Ⅱ)配對(duì)后發(fā)生磷酸化，BMP受體通過(guò)結(jié)合絲/蘇氨酸激酶受體產(chǎn)生抑制性功能受體，抑制性功能受體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Smads結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核，與smrf1因子結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物再通過(guò)與活化特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx2、Osterix等)特異性結(jié)合調(diào)節(jié)骨代謝，從而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激活BMP-Smads通路時(shí)，Runx2、Osterix作為主要受調(diào)控因子顯著上調(diào)，從而促進(jìn)BMSC的成骨分化[9]。

2.2Wnt/β-catenin信號(hào)通路 作為成骨分化過(guò)程中的又一關(guān)鍵通路，Wnt信號(hào)通路參與成骨分化的部分機(jī)制已被證實(shí)[20]。目前，已發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路參與了促進(jìn)骨形成、抑制脂肪形成及腫瘤發(fā)生過(guò)程等諸多生物學(xué)活動(dòng)[21]。根據(jù)有無(wú)β-catenin參與，Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典信號(hào)通路與非經(jīng)典信號(hào)通路兩種，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為經(jīng)典傳導(dǎo)通路已成為成骨細(xì)胞的研究熱點(diǎn)。Wnt配體及其相應(yīng)的受體和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子構(gòu)成經(jīng)典的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑成員主要包括細(xì)胞外Wnt蛋白(配體)、卷曲蛋白、β-catenin、T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)劑等，下游靶基因包括細(xì)胞周期蛋白D1、c-myc、Runx2、Osterix等，這些相關(guān)基因在成骨分化過(guò)程中起重要作用[22]。如Wnt信號(hào)通路抑制糖原合成酶激酶3β活性，促使β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)下游相關(guān)因子，相關(guān)因子作用于BMSC，促進(jìn)成骨分化[8,23-24]。近年對(duì)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，LRP5的突變可影響骨形成及骨代謝失調(diào)，從而影響骨量水平[25]。

2.3Notch信號(hào)通路 Notch作為保守的受體蛋白，其引導(dǎo)的信號(hào)通路已被證實(shí)在許多疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，如急性肝衰竭、銀屑病等，且其在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中也是研究熱點(diǎn)[26]。Notch同源分子包括4型，即Notch1、2、3、4。而Notch受體蛋白對(duì)應(yīng)的下游配體同源分子目前有5種，分別為Delta1、3、4及Jagged1、2[27-28]。體外研究發(fā)現(xiàn)，不同的激活方式使得Notch信號(hào)通路發(fā)揮了促進(jìn)成骨與抑制成骨的雙向作用，其中Notch受體蛋白通過(guò)激活Osterix/Sp7，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D、E，從而抑制成骨分化；另一方面，Notch受體蛋白通過(guò)結(jié)合Runx2，使Runx2活性下降，從而抑制成骨分化[29-30]。有學(xué)者通過(guò)培養(yǎng)能特異性激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路的小鼠，檢測(cè)Notch相關(guān)配體Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta4及相關(guān)骨代謝轉(zhuǎn)化指標(biāo)(Runx2、成骨分化特異性標(biāo)志物堿性磷酸酶)發(fā)現(xiàn)，Notch相關(guān)配體的表達(dá)明顯增加，且Runx2、堿性磷酸酶的表達(dá)水平也明顯升高，這表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過(guò)細(xì)胞因子刺激Notch信號(hào)，從而促進(jìn)BMSC成骨分化[31]。

3 調(diào)控BMSC成骨分化的miRNA

3.1miR-99a 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在含有miR-99a抑制劑的功能化支架上局部植入BMSC可以增強(qiáng)局部骨的形成，且與多能細(xì)胞的C3H10T-1/2相比，miR-99a在成骨細(xì)胞MC3T3-E1和MA5-A5中均顯著下調(diào)[7]。有學(xué)者在信使RNA的組蛋白去甲基化酶KDM6B序列3′ UTR上找到了miR-99a對(duì)應(yīng)序列，并分別將野生型和突變型KDM6B 3′UTR插入到pmirGLO熒光素酶載體，再將這些載體轉(zhuǎn)到C3H10T-1/2細(xì)胞[32]。結(jié)果顯示，野生型KDM6B中的miR-99a在低聚核苷酸的作用下，明顯抑制了熒光素酶的活性。而突變組逆轉(zhuǎn)了miR-99a的作用，減弱了熒光素酶的抑制作用。這一結(jié)果表明，miR-99a可以直接與KDMB6的3′UTR結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平。因此，KDM6B被確定為miR-99a的重要目標(biāo)之一。此外，HOX基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可通過(guò)增加Runx2表達(dá)促進(jìn)成骨分化。有學(xué)者通過(guò)研究HOX基因與成骨分化的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-99a可以顯著抑制HOXC6-1、HOXA10、HOXB2和HOXC10的表達(dá),而miR-99a抑制劑可以增加HOXC6-1、HOXA10、HOXB2和HOXC10的表達(dá)，表明miR-99a通過(guò)HOX相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控KDM6B[33]。這表明，特異性抑制miR-99a可能是一種新治療方法，其可用于增強(qiáng)基于BMSCs的成骨分化能力。

3.2miR-26a 通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a調(diào)節(jié)成骨分化的通路大致包括以下幾條：Smad1信號(hào)通路、Tob1信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、糖原合成酶激酶3β信號(hào)通路[34]。在研究人脂肪組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的過(guò)程中，可以檢測(cè)到miR-26a高表達(dá)，而Smad1蛋白表達(dá)下調(diào)。Balogh等[35]報(bào)道，miR-26a參與了多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白調(diào)控Smad1的細(xì)胞表達(dá)過(guò)程。多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白作為抑癌基因多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤致病因子1的產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中具有廣泛作用，有學(xué)者在分析人脂肪組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白及miR-26a兩者均上調(diào)，且相關(guān)成骨標(biāo)記基因Runx2、骨鈣素等也上調(diào)[35]。染色質(zhì)免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白通過(guò)與miR-26a的基因啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)其表達(dá)，表明miR-26a在人脂肪組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中可能起關(guān)鍵作用。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性內(nèi)分泌癌蛋白作為調(diào)控因子，通過(guò)miR-26a對(duì)Smad1蛋白進(jìn)行間接調(diào)控[36]。因此，miR-26a在成骨分化中扮演的角色及人脂肪組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

3.3miR-21 miR-21通過(guò)抑制快速發(fā)育生長(zhǎng)因子同源蛋白2抗體(Spry2)負(fù)反饋調(diào)節(jié)Runx2與Osterix，繼而調(diào)節(jié)BMSC成骨分化，在這一表達(dá)過(guò)程中，Runx家族成員之一Runx2起著至關(guān)重要的作用。Spry負(fù)向調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子首次在果蠅胚胎分化器官過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)[37]。此外，Spry家族由Spry1、 Spry2、 Spry3 和Spry4四個(gè)基因組成，它們?cè)谌撕痛笫笾g均高度保守。在骨質(zhì)疏松癥患者BMSC成骨分化試驗(yàn)中，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)經(jīng)miR-21轉(zhuǎn)染的人類BMSC發(fā)現(xiàn)，Spry1基因的表達(dá)下調(diào)，Runx2和Osterix過(guò)表達(dá)，從而導(dǎo)致BMSC的成骨分化增強(qiáng)。楊楠等[38]通過(guò)研究人類BMSC中的miR-21/Spry1功能軸發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-21通過(guò)抑制目標(biāo)蛋白Spry1的表達(dá)對(duì)成骨分化起促進(jìn)作用；為進(jìn)一步確定Spry1對(duì)成骨分化的抑制作用,他們對(duì)培養(yǎng)好的人類BMSC進(jìn)行miRNA及前體miR-21轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后對(duì)BMSC進(jìn)行體外觀察及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-21的堿性磷酸酶活性升高，而抑制miR-21表達(dá)，堿性磷酸酶活性明顯下降，且miR-21可通過(guò)下調(diào)Spry1，使成骨特異性基因Runx2和Osterix過(guò)表達(dá)，從而抑制成骨分化。

3.4miR-145 Sun等[39]通過(guò)降低成骨細(xì)胞中的miR-145水平，利用蛋白質(zhì)印跡法和定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Runx2、Osterix、β-catenin、T細(xì)胞因子1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-145水平的下降可以促進(jìn)Runx2、Osterix、β-catenin、T細(xì)胞因子1的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨分化，過(guò)表達(dá) miR-145通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)Osterix的表達(dá)抑制成骨分化。臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，骨發(fā)育不全患者中的miR-145表達(dá)較正常人減少[40]。而對(duì)miR-145成骨分化過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-145與叉頭框蛋白O1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即miR-145上調(diào)，叉頭框蛋白O1下調(diào)[41]。miR-145的結(jié)合位點(diǎn)位于叉頭框蛋白O1 3′ UTR的770～776堿基，Hao等[42]通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Runx2、Osterix、β-catenin、T細(xì)胞因子1的表達(dá)及對(duì)雙熒光素酶進(jìn)行分析表明，miR-145可直接負(fù)調(diào)控靶基因叉頭框蛋白O1 3′ UTR。

4 成骨分化過(guò)程中間充質(zhì)干細(xì)胞與miRNA的關(guān)系

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于體內(nèi)的組織細(xì)胞中，其定向分化能力是由多因素參與調(diào)控，各種細(xì)胞因子作用于DNA上，決定間充質(zhì)干細(xì)胞的分化方向。其中，成骨分化與成脂分化作為兩個(gè)重要的分化方向存在動(dòng)態(tài)平衡，一般抑制成脂分化的miRNA會(huì)反向促進(jìn)成骨分化。因此在基礎(chǔ)研究中，應(yīng)充分考慮miRNA可能的分化方向。miRNA作為細(xì)胞表達(dá)的重要組成部分，其在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。miRNA作用于間充質(zhì)干細(xì)胞后，調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為不同細(xì)胞，其不僅在成骨分化中有重要作用，同時(shí)也在腫瘤的發(fā)生、組織生長(zhǎng)、各個(gè)組織器官病變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在探索miRNA對(duì)成骨分化影響的這一過(guò)程中，已進(jìn)行了大量相關(guān)實(shí)驗(yàn)，包括構(gòu)建相關(guān)干擾載體，獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株、細(xì)胞株培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染，定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)及堿性磷酸酶的檢測(cè)等。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，許多不確定因素會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，如實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)、實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞株的選擇等均可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。目前，已發(fā)現(xiàn)一些miRNA在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用，如miR-2861在小鼠實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)是通過(guò)組蛋白去乙?；?增加Runx2的表達(dá)，從而對(duì)成骨分化起正向調(diào)節(jié)作用[43]。但通過(guò)基因手段治療骨代謝疾病仍需不斷探索，與成骨分化相關(guān)的miRNA在骨質(zhì)的新生與改建中發(fā)揮著不可忽視的作用，通過(guò)對(duì)這些相關(guān)miRNA進(jìn)行深入探討，將有助于更好地了解成骨分化，從而為骨代謝相關(guān)疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，大量未知miRNA的功能仍需要繼續(xù)探索，且對(duì)于大多數(shù)已知的miRNA，其調(diào)控機(jī)制、下游靶基因的選擇、表達(dá)時(shí)序性及與相關(guān)疾病的聯(lián)系等問(wèn)題亦需進(jìn)一步研究。

5 小 結(jié)

目前，已知miRNA在調(diào)節(jié)通路的激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這使其成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。通過(guò)對(duì)細(xì)胞通路的探索，可以更清晰地認(rèn)識(shí)細(xì)胞增殖過(guò)程及疾病發(fā)生過(guò)程，進(jìn)而將治療手段從藥物干預(yù)提升至基因治療。已有一些miRNA在臨床用于治療相關(guān)疾病，如在骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松的治療方面已有了較完善的基因治療理論依據(jù)。未來(lái)，應(yīng)對(duì)miRNA這一復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整體研究，進(jìn)一步探討其成骨分化機(jī)制，從而促進(jìn)成骨分化的臨床應(yīng)用和相關(guān)疾病的治療。